细胞分裂

1. 观察根尖中的细胞周期 Expand
   • 假设:实验假设是，在用诺考达唑（一种干扰微管聚合的化学物质）处理的根尖切片中，所有细胞都将停滞在细胞周期的同一阶段，而在未经处理的洋葱尖切片中，细胞周期的所有不同阶段都将可视化。零假设是两组之间的有丝分裂不会有差异，并且细胞周期的不同阶段将被可视化。
   • 为了准备这个实验，你将使用一个洋葱，这个洋葱已经在水中放置了几天，直到新的白色根尖开始发芽。用剃须刀片从其中一个根尖的末端切下 1 厘米的块。
   • 将洋葱片放入标有"N"的微量离心管中，用于诺考达唑条件。
   • 然后，切下第二块 1 cm 的洋葱根尖，放入标有"C"的微量离心管中，用于控制条件。
   • 将 2 μL 的 5 mg/mL 诺考达唑加入到标记为 N 的微量离心管中的 1 mL 水中，将 1 mL 水加入到标记为 C 的试管中。
   • 将包含根尖的试管孵育 12 小时，然后用 70% 乙醇擦拭工作区。
   • 孵育完成后，将加热块设置为 60 ºC。
   • 用水清洗经诺考达唑处理的尖端，然后吸出液体。
   • 再重复两次洗涤，总共洗涤三次。
   • 用 1 mL 的一种正常盐酸填充两个试管。将试管在 60 ºC 加热块中孵育 12 - 15 分钟，然后将酸丢弃到废瓶中。
   • 现在，将 1 mL 蒸馏水滴入试管中至少三次以冲洗样品。
   • 现在将 1 微升 DAPI 染色剂加入 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
   • 然后将 50 μL 这种稀释的 DAPI 染料放入每个试管中，并在室温下孵育 12 分钟。
   • 在此之后，按照步骤 10 进行三次蒸馏水洗涤。
   • 将一张显微镜载玻片标记为"对照"，将另一张标记为"诺考达唑"。
   • 将染色的根转移到各自的显微镜载玻片上，并在对照载玻片中加入一滴水，在诺考达唑载玻片中加入一滴诺考达唑。
   • 使用剃须刀片去除每个根尖的未染色部分，并将玻璃盖玻片放在每个样品上。
   • 用戴手套的指尖小心地按下每个盖玻片，然后让载玻片静置 10 分钟。
   • 最后，在荧光显微镜的 40 倍物镜下查看载玻片并捕获根尖细胞制备的图像。
2. 了解细胞周期控制的丧失 Expand
   • 注意:在细胞通过细胞周期的所有阶段之前，它们必须经过几个检查点。这些检查点受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶蛋白 （CDK） 的调节。如果细胞周期蛋白和 CDK 确定先前的细胞事件尚未充分完成，它们将在此步骤中阻止细胞并阻止它们增殖。在癌细胞中，用于调节细胞分裂的分子约束中的一种或几种丢失，这使得受损细胞能够逃脱细胞增殖控制。这些异常细胞发展成肿瘤，这些肿瘤是大量不受控制的增殖细胞，会干扰身体的正常功能。请注意，在分裂之前，这个癌细胞是如何在光学显微镜下非常强烈地聚集和折射光线的。这是因为并非所有癌细胞在每轮有丝分裂后都能成功分裂成子细胞。这意味着它们通常含有过量的细胞器和 DNA，而细胞含量的增加意味着它们将比正常细胞更强烈地折射光。
3. 结果 Expand
   • 检查您收集的图像，并在表 1 中记录在用诺考达唑处理的洋葱尖片中可以识别的不同细胞结构和阶段。点击这里下载表 1
   • 如果有任何细胞正在经历有丝分裂，请记下您看到的细胞分裂阶段。
   • 在表 1 中记录有丝分裂每个阶段的细胞百分比。
   • 接下来，检查未处理的洋葱尖切片的图像，并记录您可以识别的细胞结构。
   • 如果有任何细胞正在经历有丝分裂，请考虑您看到的细胞分裂阶段，并在表 1 中记录每个有丝分裂阶段的细胞百分比。

实验假设是，在用 nocodazole（一种干扰微管聚合的化学物质）处理的根尖切片中，所有细胞都将停滞在细胞周期的同一阶段，而在未经处理的洋葱尖切片中，细胞周期的所有不同阶段都将可视化。零假设是两组之间的有丝分裂不会有差异，并且细胞周期的不同阶段将被可视化。为了准备这个实验，您将使用一个洋葱，该洋葱已放入水中几天，直到新的白色根尖开始发芽。

使用剃须刀片从其中一个根尖的末端切下一厘米的块。将洋葱片放入标有 N 的微量离心管中，用于诺考达唑条件。然后切下第二块 1 厘米的洋葱根尖，放入标有 C 的微量离心管中作为对照条件。

在标有 N 的微量离心管中加入 2 微升 5 毫克/毫升的诺考达唑到一毫升水中，向标有 C 的试管中加入一毫升水。将含有根尖的试管孵育 12 小时，并用 70% 乙醇擦拭工作区。孵育完成后，将加热块设置为 60 摄氏度。用水清洗经诺考达唑处理的吸头，然后吸出液体。

重复此洗涤 2 次，总共洗涤 3 次。在两个试管中填充 1 毫升 1 毫升 1 个正常盐酸。将试管在 60 摄氏度的加热块中孵育 12 至 15 分钟，然后将酸倒入废瓶中，向试管中滴入 1 毫升蒸馏水至少 3 次以冲洗样品。

现在将 1 微升 DAPI 染色剂添加到 10 毫升磷酸盐缓冲盐水中。然后将 50 μL 稀释的 DAPI 染料放入每个试管中，并在室温下孵育 12 分钟。在此瓶坯之后，如刚才所示，进行三次蒸馏水洗涤。

将一个显微镜载玻片标记为对照，将另一个标记为诺考达唑。将染色的根转移到各自的显微镜载玻片上，向对照载玻片中加入一滴水，向诺考达唑载玻片中加入一滴诺考达唑。使用剃须刀片去除每个根尖的未染色部分，并将玻璃盖玻片放在每个样品上。

用戴手套的指尖小心地按压每个盖玻片，然后让载玻片静置 10 分钟。最后，在光学或荧光显微镜的 40 倍物镜下观察载玻片，并捕获根尖细胞制备物的图像。在细胞通过细胞周期的所有阶段之前，它们必须通过几个检查点。

这些检查点受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶蛋白 （CDK） 的调节。如果细胞周期蛋白和 CDK 确定先前的细胞事件尚未充分完成，它们将在此步骤中阻止细胞并阻止它们增殖。在癌细胞中，用于调节细胞分裂的分子约束中的一种或几种丢失，这使得受损细胞能够逃脱细胞增殖控制。

这些异常细胞发展成肿瘤，这些肿瘤是大量不受控制的增殖细胞，会干扰身体的正常功能。请注意，在分裂之前，这个癌细胞是如何在光学显微镜下非常强烈地聚集和折射光线的。这是因为并非所有癌细胞在每轮有丝分裂后都能成功分裂成子细胞。

这意味着它们通常含有过量的细胞器和 DNA，而细胞含量的增加意味着它们将比正常细胞更强烈地折射光。现在，所有数据都已收集完毕，让我们看看结果。在用 nocodazole 处理的洋葱尖片中可以鉴定出哪些细胞结构？

是否有任何细胞正在发生有丝分裂？您看到细胞分裂的哪些阶段？在表中记录有丝分裂每个阶段的细胞百分比。

接下来看看未处理的洋葱尖片。您可以识别哪些细胞结构？是否有任何细胞正在发生有丝分裂？

您看到细胞分裂的哪些阶段？在表中记录有丝分裂每个阶段的细胞百分比。您会注意到，由于试剂的微管破坏特性，诺考达唑处理的洋葱片中的大多数细胞都处于有丝分裂的同一阶段，从而阻止纺锤体纤维的形成以及随后的染色体分离和细胞分裂。

然而，在未经处理的切片的细胞中可以看到有丝分裂的许多不同阶段，因为有丝分裂是健康生物体中一个持续的过程。