实时RT-PCR

实时逆转录-聚合酶链反应或实时 RT-PCR 可以在反应进行过程中定量目标 RNA。

首先，逆转录酶将 RNA 复制到互补 DNA 或 cDNA 中。RNase H 消化原始 RNA，留下附着在 cDNA 上的小引物。

然后通过 DNA 聚合酶合成互补链。

然后可以使用 PCR 进行靶向扩增，以创建特定片段的指数拷贝。在高温下，每个循环开始时，两条链被分离。互补寡核苷酸引物然后退火到每条 cDNA 链上，并通过 DNA 聚合酶延伸。

可以使用两种不同的基于荧光的检测方法之一对 DNA 进行定量。一种方法使用仅在与双链 DNA 结合时发出荧光的染料。

染料与 DNA 结合，其中原始链与新合成的互补链配对。在每个 PCR 循环结束时，适当波长的光会激发结合的染料。

另一种方法使用与荧光团和淬灭基团分子相连的互补序列特异性寡核苷酸探针。

反应物连续暴露在适当波长的光下，淬灭基团分子在彼此靠近时吸收荧光团的荧光。DNA 聚合酶在延伸过程中分离荧光团，防止淬灭。

基于探针的方法具有特异性，因为它仅附着在目标序列上。相比之下，基于染料的方法具有非特异性，并且与所有双链 DNA 结合。

在任何一种情况下，激发的荧光基团发出的荧光都由光电探测器感应，光电探测器将接收到的信号转换为数字输出。

阈值循环 （Ct） 是荧光达到远高于背景荧光的设定水平的 PCR 循环次数。

阈值循环与初始样品中靶标 RNA 的量成反比 — 阈值循环越低，目标 RNA 的量越高。

绝对定量将阈值循环或荧光强度与使用已知 DNA 浓度制备的标准曲线进行比较。

或者，相对定量将样品的荧光与参比的荧光进行比较。该方法可用于比较不同条件下基因表达的变化。