33.4: 免疫荧光显微镜

荧光显微镜使用称为荧光染料的荧光发色团，它可以从光源吸收能量，然后将这些能量以可见光的形式发射出来。荧光染料包括天然荧光物质（如叶绿素）和荧光染色剂，这些物质被添加到标本中以产生对比。Texas red 和 FITC 等染料是荧光染料的例子。其他例子包括核酸染料 4’，6′-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和吖啶橙。

显微镜用短波长激发光（如紫外线或蓝光）照射样品。发色团吸收激发光并发射波长较长的可见光。然后过滤掉激发光（部分原因是紫外线对眼睛有害），这样只有可见光通过目镜，从而在黑暗背景下产生明亮色彩的标本图像。

荧光显微镜可以识别病原体，发现环境中的特定物种，或发现细胞内特定分子和结构的位置。还开发了根据活细胞是否吸收特定荧光染料来区分活细胞和死细胞的方法。有时，在同一样品上使用多种荧光染料以显示不同的结构或特征。

荧光显微镜最重要的应用之一是免疫荧光，它用于通过观察抗体是否与某些微生物结合来识别它们。（抗体是免疫系统产生的蛋白质分子，附着在特定病原体上以杀死或抑制它们。该技术有两种方法:直接免疫荧光测定 （DFA） 和间接免疫荧光测定 （IFA）。在 DFA 中，特异性抗体（例如，靶向狂犬病病毒的抗体）用荧光染料染色。如果标本中含有靶向病原体，则可以在荧光显微镜下观察抗体与病原体的结合。这是一种一抗染色剂，因为染色的抗体直接附着在病原体上。

在 IFA 中，二抗使用荧光染料而不是一抗染色。二抗不直接附着在生物体上，而是与一抗结合。当未染色的一抗与病原体结合时，可以观察到荧光二抗与一抗结合。因此，二抗间接连接到病原体上。由于多个二抗通常可以附着在一抗上，因此 IFA 增加了附着在样本上的荧光抗体的数量，使其更容易可视化其特征。