Denna procedur beskriver hur man kan upprätta primära hematopoetisk cellkulturer från murina benmärg och följs av transfektion med Gene Pulser MXCell elektroporation system.
Det blir allt tydligare att elektroporation är det mest effektiva sättet att införa plasmid DNA eller siRNA i primära celler. Den Gene Pulser MXcell elektroporation systemet och Gene Pulser elektroporation buffert har utvecklats speciellt för att transfektera nukleinsyror in i däggdjursceller och svåra att transfektera celler, t.ex. primär och stamceller cells.This video visar hur du etablera primära hematopoetisk cellkulturer från murina benmärg , och sedan förbereda dem för elektroporation i MXcell systemet. Vi börjar med att isolera lårben och skenben. Benmärg från både lårbenet och skenbenet är sedan skördas och kulturer är etablerade. Odlade benmärgsceller sedan transfekterade och analyseras.
När fler genetisk information framkommer och nya verktyg som t.ex. siRNA utvecklas, har användningen av fysiologiskt relevanta celler blir allt viktigare att öka våra kunskaper om sjukdomen vägar, protein-protein växelverkan, och signaltransduktion. Primära celler erhålls direkt från vävnader eller vätskor och odlas in vitro. Dessa celler kan manipuleras på ett antal sätt, bland annat genom införandet av genetiskt material. Det blir allt tydligare att det mest effektiva sättet att införa plasmid DNA eller siRNA i primära celler elektroporation.
Elektroporation utsätter celler för elektriska pulser för att övergående öka permeabilitet cellmembranet, vilket möjliggör exogen nukleinsyror att komma in i cellen. Denna metod för transfektion kan optimeras för att rymma för skillnader mellan olika celltyper / linjer och därmed kan användas för att transfektera mastceller, liksom alla andra härledd från benmärg cell. Till skillnad från virus-medierad transfektion, medför elektroporation inte gränser för storleken på transfekterade DNA, och inte heller kräva omfattande förberedelser. I motsats till lipid-medierad transfektion kan elektroporation vara mindre giftiga och inte leder till endosomal fånga de transfekterade nukleinsyra.
Bio-Rad har utvecklat MXcell elektroporation systemet specifikt för dessa celler. den MXcell gör att du kan variera förutsättningar för att maximera din transfektion effektivitet och cellernas livskraft. För att optimera transfektion effektiviteten och minimera celldöd, en mångfald av elektroporation parametrar, bland annat spänning, kan kapacitans, resistans och pulslängd ställas och utvärderas.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | ||
Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |