小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

摘要

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell 电穿孔系统进行转染。

摘要

电穿孔正日益显现出其作为将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效方法的优势。Gene Pulser MXcell 电穿孔系统与Gene Pulser 电穿孔缓冲液专为向哺乳动物细胞以及难转染细胞（如原代细胞和干细胞）转染核酸而设计。本视频演示了如何从小鼠骨髓建立原代造血细胞培养，并为其在MXcell系统中进行电穿孔做准备。我们首先分离股骨和胫骨，收集来自股骨和胫骨的骨髓，建立细胞培养。随后对培养的骨髓细胞进行转染并分析。 关键词：电穿孔，原代细胞，质粒DNA，siRNA，Gene Pulser MXcell，Gene Pulser 电穿孔缓冲液，核酸转染，哺乳动物细胞，原代造血细胞，小鼠骨髓，股骨，胫骨，干细胞

方案

从股骨和胫骨中采集骨髓

1. 该操作的第一步是从6至12周龄小鼠的股骨和胫骨中采集骨髓（我们使用的是BALB/c小鼠，但该操作适用于任何品系的小鼠）。首先，通过吸入CO₂对小鼠实施安乐死（此处不展示）。从每只小鼠的后肢取下股骨和胫骨。然后，用剃须刀片切除股骨两端，去除髋关节和膝关节，以暴露骨髓。
2. 以类似方式，切除胫骨两端，去除邻近膝关节和踝关节的区域，以暴露骨髓。
3. 取一支3 mL注射器，安装26号针头，并吸入含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和β-巯基乙醇（BME = 100 uM）的RPMI培养基。用镊子夹住骨骼，将其置于含有RPMI培养基的培养皿上方。将注射器针头插入骨骼一端，推动活塞以冲洗出骨髓。可在骨骼内部上下移动针头，以充分冲洗残留的骨髓。
4. 对所有骨骼重复上述操作，随后开始建立培养体系。

建立培养物

1. 为建立骨髓培养，用移液器将冲洗出的骨髓组织反复吹打数次，以将组织分散成单细胞悬液。
2. 将一个70微米滤膜置于50 mL锥形离心管上，然后将细胞悬液加入滤膜中。
3. 用RPMI冲洗一次培养皿，再将冲洗液加入70微米滤膜中。
4. 使用1 mL注射器活塞的橡胶端，研磨残留在70微米滤膜上方的骨髓组织碎片。
5. 用RPMI冲洗滤膜一次。
6. 冲洗后，将细胞悬液在1200 rpm下离心5分钟。
7. 通过在PBS中重悬，洗涤细胞沉淀。
8. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常从小鼠骨骼（两根股骨加两根胫骨）可获得约9000万个细胞。计数后，再次以1200 rpm离心5分钟。
9. 将细胞重悬于少量RPMI中，并分装至组织培养瓶中，加入足量RPMI使最终细胞浓度为每毫升100万个细胞。
10. 添加细胞因子以促进目标细胞类型的发育。本实验中加入细胞因子白细胞介素-3（IL-3 = 10 ng/mL）以促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞的发育。如需获得嗜碱性粒细胞，培养10天；如需获得肥大细胞，则需培养5周。在培养肥大细胞期间，应每周更换一次培养基和IL-3。
11. 此图为刚接种后肥大细胞的形态。该图像展示了加入白细胞介素-3后10天，骨髓细胞向嗜碱性粒细胞和肥大细胞分化的结果。
12. 获得目标细胞类型后，进行电穿孔步骤。

 

电穿孔细胞

1. 开始电穿孔步骤时，确定培养瓶中的细胞数量。
2. 细胞通常以每毫升1000万个的密度进行电穿孔，因此将所需数量的细胞转移至锥形管中，并在1200 rpm下离心5分钟。
3. 离心后，吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞，再以1200 rpm离心5分钟。
4. 吸除PBS，加入Bio-Rad Gene Pulser电穿孔缓冲液，制备成每毫升含1000万个细胞的细胞悬液。
5. 重悬细胞后，加入所需浓度的质粒DNA，终浓度为每毫升10至20微克。
6. 将150微升细胞悬液分装至96孔电穿孔板中选定的孔内。
7. 将电穿孔板放入MXcell板腔中，并关闭盖子。
8. 在转染肥大细胞之前，除非使用预设或已存储的程序，否则必须将电穿孔程序设定至MXcell设备中。通过优化实验我们发现，使用方波脉冲程序可获得最高的肥大细胞转染效率。我们将在板上设置不同的电穿孔条件，以2000 µF和1000欧姆的参数分别施加300 V/20 ms、350 V/15 ms、350 V/20 ms和350 V/10 ms的方波脉冲。程序设定并加载到设备后，按下“Pulse”按钮对细胞进行电穿孔。
9. 电穿孔完成后，将细胞转移至组织培养板中。通常将每份150微升的电穿孔样品转移至48孔组织培养板的一个孔中，孔内已含有300微升RPMI培养基（添加10%胎牛血清、青霉素、链霉素和β-巯基乙醇）以及每毫升10纳克的白细胞介素-3。细胞在37°C孵育过夜，24小时后检测表达与抑制情况。

转染结果

视频中展示了使用每毫升20微克GFP质粒成功进行电穿孔后细胞的荧光显微镜图像。使用MXcell电穿孔系统可获得约30%的转染效率。该系统允许您调节条件以最大化转染效率，同时保持细胞活力。

讨论

随着越来越多的基因组信息涌现以及siRNA等新工具的开发，使用生理相关性细胞对于进一步理解疾病通路、蛋白质相互作用和信号转导变得愈发重要。原代细胞直接从组织或体液中获取，并在体外进行培养。这些细胞可通过多种方式进行操控，包括引入外源性遗传物质。目前越来越明确的是，将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效的方法是电穿孔法。

电穿孔通过使细胞暴露于电脉冲中，暂时增加细胞膜的通透性，从而允许外源核酸进入细胞。这种转染方法可根据不同细胞类型或细胞系的差异进行优化，因此可用于转染肥大细胞以及任何其他骨髓来源的细胞。此外，与病毒介导的转染不同，电穿孔对转染DNA的大小没有限制，也无需复杂的准备工作。与脂质体介导的转染相比，电穿孔的毒性更低，且不会导致转染核酸被困在内吞体中。

伯乐公司已为这些细胞专门开发了MXcell电穿孔系统。该系统可让您调整条件，以最大化转染效率和细胞存活率。为了优化转染效率并最小化细胞死亡，可调节并评估多种电穿孔参数，包括电压、电容、电阻和脉冲时长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gene Pulser MXcell 电穿孔系统	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser 电穿孔缓冲液	Bio-Rad	165-2677