小鼠明暗转换实验

摘要

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。

摘要

尽管小鼠基因组序列已全部测定完成，但我们仍不了解其中大多数基因的功能。然而，利用基因靶向技术可以在小鼠中删除或操控特定基因。通过分析基因突变小鼠的行为表型，即可确定特定基因对某种行为的影响。在对基因突变小鼠进行行为表型分析时，明暗穿梭实验是目前最常用的小鼠焦虑样行为检测方法之一。该实验基于小鼠天生回避明亮区域的特性，以及其在新环境中自发探索的行为特征。该实验对具有抗焦虑作用的药物处理具有敏感性。实验装置由一个黑暗区域和一个明亮照明区域组成，允许小鼠在两个区域之间自由穿梭。小鼠进入明亮区域的次数以及在其中停留的时间，是衡量其对明亮空间产生焦虑程度的指标。为了获得可在不同实验室之间重复并相互比较的突变小鼠品系表型数据，各实验室应尽可能采用一致的行为学检测方法。然而，目前各实验室之间存在的操作差异，使得实验结果难以重复或相互比较。在此，我们以视频形式展示我们实验室的明暗穿梭实验操作流程，以便更清晰地呈现各步骤的细节。在本实验室中，我们已使用该视频所示的标准化流程评估了超过60个品系的基因突变小鼠。这些数据将作为我们正在构建的公共数据库的一部分予以公开。

该实验方案的可视化将有助于深入理解整个实验操作的细节，促进各实验室之间所用方案的标准化，并便于比较利用此检测方法评估的不同突变小鼠品系的行为表型。

方案

1. 用于明暗转换实验的装置由一个笼子（21x42x25 cm）组成，笼子通过带门的隔板均分为两个相等的部分（Ohara & Co., Tokyo）。
2. 小鼠每笼饲养3至4只，饲养环境为12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为上午7:00），可自由获取食物和水。理想情况下，在断奶时进行基因型鉴定后立即重新组合小鼠，使两只对照小鼠与两只突变小鼠共同饲养。行为学测试在上午9:00至下午6:00之间进行。所有含小鼠的笼子在第一次试验开始前30分钟转移至行为测试室。
3. 其中一个腔室由白色二极管照明（390 lux），而另一个腔室为黑暗环境（2 lux）。将小鼠放置于黑暗侧，当红外摄像机检测到小鼠后，3秒后自动打开门。使用该门的目的是防止小鼠因试图逃离实验操作者而在释放后立即进入明亮腔室，因为进入明亮腔室的潜伏期可作为焦虑样行为的指标。
4. 小鼠可在门打开的情况下在两个腔室之间自由活动10分钟。用于采集和分析行为数据的应用程序（Image LD4）基于公共领域的Image J程序（由美国国家精神卫生研究所Wayne Rasband开发，可访问http://rsb.info.nih.gov/ij/获取），并由宫川刚修改（可通过日本东京O'Hara & Co.获取）。
5. Image LD4程序记录每个腔室内的移动距离、总穿梭次数、在每个腔室中停留的时间以及进入明亮腔室的潜伏期。
6. 每次试验后，所有腔室均使用超低浓度次氯酸水清洁，以避免因嗅觉线索导致的偏差。

讨论

尽管小鼠基因组序列已全部测定，但大多数基因的功能仍不清楚。然而，基因靶向技术可用于在小鼠中删除或操控特定基因（Aiba 等，2007；Austin 等，2004）。通过分析突变小鼠的行为，可确定特定基因对某种行为的影响（Takao 和 Miyakawa，2006；Takao 等，2007）。在突变小鼠行为表型分析的测试中，明暗穿梭实验是测量小鼠类焦虑行为最常用的实验之一（Crawley，2000）。该实验基于小鼠对明亮区域的天然厌恶，以及其在新环境中自发探索的行为特征（Crawley，1985）。该实验对具有抗焦虑作用的药物处理敏感（Crawley，1985）。实验装置由一个暗室和一个明亮照明的房间组成，两个房间之间通过一个高3 cm、宽5 cm的狭窄开口相连。小鼠可自由在两个房间之间移动。进入明亮房间的次数以及在其中停留的时间被用作评估小鼠对明亮空间焦虑程度的指标。

明暗交替实验最初由 Crawley 及其同事开发（Crawley 和 Goodwin，1980）。他们的原始版本与我们的测试存在两个差异。首先，在原始版本中，明室大于暗室，而在我们的测试版本中，两个室的大小相同。其次，在原始版本中，明室无顶盖，且明室的壁是透明的（Crawley 和 Goodwin，1980），而我们使用不透光的白色塑料作为明室的顶盖和壁。这些差异，即明室的大小和开放性，使得原始版本能够同时检测对明亮空间的焦虑和对开放空间的焦虑。然而，在我们的实验室中，小鼠的开放空间焦虑样行为是通过高架十字迷宫进行测试的。由于使用不透光的壁和顶盖、明室的尺寸以及我们特定的明暗交替实验方案，我们的测试相较于原始版本更专注于检测对明亮空间的焦虑。

尽管明暗交替实验和高架十字迷宫均用于评估类似焦虑的行为，但结果并不总是一致。例如，前脑特异性钙调磷酸酶基因敲除小鼠在明暗交替实验中进入明室的时间减少，但在高架十字迷宫中进入开放臂的时间却增加（Miyakawa 等, 2003）。我们推测，明暗交替实验和高架十字迷宫测试评估的是类似焦虑行为的不同方面，例如对明亮空间的焦虑和对开放空间的类似焦虑行为。为验证这一假设，我们使用了在同一组小鼠中进行两项测试所收集的大规模数据集。在本实验室中，我们开展涵盖多个行为领域的测试组合，以筛选基因的行为学意义。该测试组合需要数周时间才能完成。在测试期间，小鼠笼具保存于本机构的笼架上。若小鼠来自其他机构，则需在本设施环境中适应至少1周。适应期结束后，小鼠接受一般健康检查和神经功能筛查（Miyakawa 等, 2003），完成这些初步检查后，再进行明暗交替实验。该实验在隔音的实验室内进行，在小鼠进入实验室内适应30分钟后开始，具体过程如视频所示。

我们已使用本视频中展示的方案评估了60多个基因工程突变小鼠品系，并获得了超过3000只小鼠（包括野生型和突变型小鼠）的大量原始数据。我们对这些原始数据进行了因子分析。事实上，我们从每项测试中检测到了不同的因子（未发表数据），尽管各项指标之间存在一些显著相关性（未发表数据）。这些数据将作为我们正在构建的公共数据库的一部分予以公开。

在我们的测试组合中，通常使用野生型同窝小鼠作为对照。作为背景品系，C57BL/6J 小鼠被广泛使用。我们收集了在测试组合中作为突变小鼠对照的 C57BL/6J 小鼠的数据。C57BL/6J 小鼠在明暗穿梭实验中获得的指标如下（n=795；均值 ± 标准误）：在明室中移动距离为 846.5 ± 8.88 cm，在暗室中为 1478.5 ± 9.53 cm；在明室中停留时间为 215.8 ± 1.85 s，在暗室中为 395.8 ± 1.86 s；在两个区域之间穿梭的次数为 30.52 ± 0.43；首次进入明室的潜伏期为 64.94 ± 2.40 s。摄像头会检测小鼠在两个区域入口附近的活动，并将该时间计入两个区域的停留时间中。因此，小鼠在明区和暗区平均停留时间之和大于整个测试的总时长（600 s）。

在本实验方案中，首先将小鼠放入暗室。小鼠进入暗室3秒后，两室之间的门会自动打开，小鼠可自由穿梭于两个室之间。C57BL/6J小鼠在明室中停留的时间少于在暗室中的时间（p<0.0001；在明室停留的持续时间为215.8 ± 1.85 s，在暗室停留的持续时间为316.3 ± 2.11 s［在暗室的停留时间不包括首次进入明室前最初的暗室停留时间］，n=795，配对t检验）。这表明C57BL/6J小鼠倾向于回避明室，且在明室中停留的时间可作为评估类焦虑行为的良好指标。

由于所有数据均采用相同方案获得，因此可轻松比较不同品系突变小鼠的实验结果。为了获得可重复且能与其他突变体数据进行比较的表型分析结果，各实验室之间的行为学检测方法应尽可能保持一致。Crabbe 及其同事使用完全相同的近交品系和一种基因敲除突变品系，检测了小鼠行为与实验环境之间的相互作用。在该研究中，实验装置、检测方案以及许多环境变量均被严格标准化。尽管如此，他们仍发现不同实验室之间存在系统性行为差异，尽管在所有行为检测中也都观察到了品系间的差异（Crabbe et al., 1999）。他们指出，无法控制的变量以及用于表征突变体的实验可能产生仅适用于特定实验室的结果。实验室之间存在的操作差异使得实验结果难以在不同实验室之间重复或比较。本文中，我们以视频形式展示了明暗转换实验的操作方案，以便详细演示该方案的具体步骤。

对实验方案进行视觉记录有助于更深入地理解实验操作的各个细节，从而促进不同实验室之间所用方案的标准化，并便于比较利用该测试评估的不同突变小鼠品系的行为表型。我们行为测试组合中使用的其他实验方案（如高架十字迷宫、敞箱实验、强迫游泳实验、恐惧条件反射等）的视频资料目前正在制作中，将以未来的视频期刊文章形式发表。