高分辨率视频追踪成年黑腹果蝇的运动行为

摘要

Drosophila melanogaster 复杂运动行为的研究依赖于对果蝇个体运动变化的量化能力。本文演示了如何使用高分辨率追踪系统实现这一目标。

摘要

果蝇为研究复杂行为提供了重要的模型，因为该领域研究人员可利用丰富的遗传学工具。研究果蝇的运动行为在Drosophila melanogaster依赖于能够量化在特定任务期间或响应特定任务时运动状态的变化。因此，高分辨率视频追踪系统（如本文所述）是实时测量运动行为的有力工具。本实验方案包括使用初始气流脉冲打破果蝇的动量，随后在方形观察室中进行30秒的录像。通过追踪程序以10毫秒为间隔计算每只果蝇在观察室内的瞬时速度。分析软件随后整合这些数据，并输出多种参数，如平均速度、最大速度、运动时间、加速度等。本方案将详细讨论行为学实验中果蝇的正确饲养与管理、无需麻醉或固定条件下的果蝇操作、受控环境的建立，以及从开始到结束完整运行该检测的流程。

方案

第一部分：果蝇的饲养与管理

1. 果蝇应饲养在含有无酵母标准培养基的培养瓶中。由于需要大量果蝇，因此需相应地设置杂交。果蝇应在25ºC、12小时光照：12小时黑暗的条件下培养。
2. 果蝇应在羽化后尽快收集（羽化后1–3天）。在此阶段可使用二氧化碳扩散器操作果蝇，并将其分选至含有高压灭菌或无酵母培养基的试管中。我们仅使用雄性果蝇，每支试管存放10只。
3. 使用二氧化碳处理后，应至少静置一天至两天，再进行行为学实验。我们在果蝇羽化后3–5天进行行为学检测。
4. 为避免昼夜节律的影响，每天的实验应始终在相同的时间段（2–3小时内）进行。

第二部分：在受控环境中设置追踪系统

1. 所有实验均在环境控制室中进行，室温恒定为 25ºC，相对湿度为 70%。
2. 将数码摄像机悬置于待记录区域上方（镜头朝下）。由于我们的追踪软件基于对比度成像，因此将摄像机安装在光源箱上方。摄像机通过火线连接直接将视频记录到戴尔计算机上。我们使用夏普数码摄像机，并通过 Windows Movie Maker（Vista 版本）软件在戴尔计算机上进行视频采集。
3. 本实验方案中将施加气流脉冲，因此实验室内必须具备气流源。使用橡胶管将气流源连接至活性炭过滤器，以实现空气过滤。
4. 再用橡胶管将活性炭过滤器的另一端通过空心橡胶塞连接至锥形瓶，并在瓶内加入约半英寸深的水，以对空气进行加湿。
5. 锥形瓶应带有侧臂，通过橡胶管连接至Y形阀。
6. Y形阀的一个分支连接至流量计，另一个分支则将气流输送至方形运动记录室。

第3部分：将果蝇运送至运动行为检测室

1. 方形运动室基于 Wolf et al. 2002¹ 的设计，并增加了小型落差托盘以防止果蝇在室内飞行。使用前应将运动室拆开，所有部件均需用 70% 乙醇彻底擦拭并干燥。
2. 在进行行为检测前立即麻醉果蝇可能会影响其表现。为避免此问题，应使用带有小出口的漏斗将果蝇轻轻敲入运动室。为制作合适尺寸的出口，可将一个蓝色移液器吸头（适用于 P1000）连接到漏斗末端，并用剪刀剪去吸头最末端，使开口足够大以允许果蝇通过。
3. 本实验所用运动室的顶部是一块由边缘螺丝固定的亚克力板。当移除螺丝后，这些孔可用于将果蝇导入室内。将亚克力板顶部放置到位，使螺丝孔正好位于内室上方，而不是通常的螺丝位置。取一支装有果蝇的试管，倒置在漏斗上，然后将漏斗插入螺丝孔中。
4. 切勿移动漏斗，以免伤害或损伤果蝇。相反，应轻轻敲击整个装置（包括运动室和漏斗），直至所有果蝇均进入室内。敲击时应将装置放在鼠标垫上，以吸收冲击力。当果蝇全部进入后，移除漏斗，并将亚克力板重新对准螺丝孔位，然后重新拧紧螺丝固定顶部。

第4部分：进行运动行为检测

1. 将果蝇正确装载后，让其在实验腔室内适应30分钟。此适应阶段应在受控环境（25ºC，70%湿度）中进行，并将腔室置于已开启的光源箱上方。关闭室内其他光源。
2. 适应期结束后，切换气流系统中的Y型阀，使气流仅通向流量计。开启气源，并将气流速度逐步调节至所需流速（4.0–6.0 L/min）。我们通常使用5.0–5.5 L/min，但该范围内的任何流速均可适用。
3. 达到目标气流速度后，切换Y型阀，使气流进入运动检测腔室。控制气流脉冲持续15秒，随后突然关闭气流。在关闭气流的同时，将摄像机切换至录像模式。（此步骤需练习以确保动作同步）。
4. 在达到所需记录时间后停止录像并保存。我们以每秒10帧的速度记录30秒的试验视频（每种基因型至少记录8次试验）。

第5部分：视频分析

1. 我们使用动态图像分析系统（DIAS）软件 3.2 进行运动追踪²。为了使用该软件，我们首先使用 Quicktime 7.5.5 将视频转换为 AVI 文件格式。
2. 为了基于对比度追踪果蝇，我们使用“通过阈值自动追踪”功能。然后使用“由追踪生成路径”功能将这些轨迹数字化。
3. 为了输出每只果蝇的瞬时速度，我们使用“计算参数”功能生成一个数据库文件（DIAS 专用）。使用该功能时，我们还采用“5,15,60,15,5”Tukey 平滑窗口对数据进行平滑处理。
4. 一旦该信息以数据库文件形式输出，即可在 Microsoft Excel 中打开。我们使用 Matlab 脚本在 Excel 中整合瞬时速度，并计算理解运动动力学和运动片段结构所需的其他参数。

代表性结果：

图1显示了野生型Canton S个体的代表性轨迹（图1，左图）以及通过杂交两个大片段重叠缺失（Df(3R)x307 和 Df(3R)x313）获得的dCASK基因功能缺失果蝇的轨迹（图1，右图）。先前研究已表明，dCASK功能缺失果蝇在Buridan行为范式中表现出运动障碍³；在本实验范式中，与Canton S相比，这些果蝇的运动能力显著下降。我们始终优先测试野生型个体，以确保当天的实验条件和行为表现处于正常范围内。在少于5%的测试日中，我们观察到与标准反应的偏离，这些差异通常可归因于受控环境参数的问题。

图1. 由DIAS生成的Canton S野生型果蝇（上方左侧）和通过重叠缺失产生的运动缺陷型dCASK无效果蝇（上方右侧）的运动轨迹。这些轨迹反映了录制视频中所观察到的情况。两张图片均显示了在气流刺激后，8-10只果蝇在视频追踪实验中持续30秒的运动轨迹。

图2. 野生型果蝇在受到气流脉冲（紫色条）和未受到气流脉冲（蓝色条）后，在运动行为检测中进行了测试（上图）。分析程序计算的所有参数在两种条件下均无显著差异（通过双尾学生t检验确定）。这表明在气流脉冲后，果蝇在我们的实验装置中运动行为正常。

讨论

在我们的实验装置中，一股中等强度的气流脉冲会暂时停止果蝇的运动。当气流脉冲结束时，果蝇从这种静止状态中释放，恢复正常运动，如图2所示。由于该气流脉冲能有效同步群体的运动行为，我们利用它来启动实验，以便研究在打破动量的刺激之后运动的起始过程。然而，该检测也可以不使用气流脉冲进行，因为启动后的运动参数不受气流脉冲的影响（图2）。

在运动行为的自动化分析中，一个常见问题是碰撞问题。大多数追踪程序在处理果蝇碰撞时表现极差。这些程序在碰撞过程中常常会短暂“丢失”目标，当重新检测到该目标时，会将其标记为一个新对象。其结果可能导致输出的轨迹数量远多于实际存在于实验腔内的对象数量。许多人通过追踪单只果蝇来解决这一问题。然而，这种方法的明显缺陷在于，由于社会性信号在黑腹果蝇（Drosophila）行为与运动中起重要作用，单只果蝇的行为可能与群体行为存在显著差异⁴。当然，这并不一定是缺点，具体取决于研究目的；但就我们的研究目标而言，更倾向于使用果蝇群体以提高统计效力。因此，我们通过两种方式应对碰撞问题。首先，每次实验仅使用8至10只果蝇（在56 mm见方的实验腔...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
方形室	工具	机械加工车间	N/A	设计源自 Wolf et al. 20021
数码相机	相机	Sharp	ViewcamZ VL-23
流量计	工具	Cole-Parmer	SY-32003-12
光源箱	工具	DNASTAR	Seq-Easy
活性炭过滤器	工具	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	软件	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com