本文演示了将核输入底物进行细胞质显微注射至Xenopus laevis卵母细胞中的操作，以及对注射后的卵母细胞进行超薄切片电子显微镜观察的样品制备方法。
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本文内容
摘要
摘要
对Xenopus laevis卵母细胞进行显微注射，随后进行超薄切片电子显微镜（EM）观察，是研究核质运输的优良体系。由于其细胞核体积大且核孔复合体（NPCs）密度高，核转运过程在Xenopus卵母细胞中易于观察。通过该体系，研究人员已深入了解了核输入与核输出的多种机制（参见Panté, 2006年的综述）。此外，我们还利用Xenopus卵母细胞的显微注射技术，解析了多种在宿主细胞核内复制的病毒的核输入途径。
本文演示了将核转运底物进行细胞质显微注射至Xenopus卵母细胞的操作方法。同时展示了注射后卵母细胞的制备步骤，以便通过超薄切片电镜进行观察，包括卵母细胞的解剖、脱水以及包埋于环氧树脂中的过程。最后，我们提供了用杆状病毒Autographa californica核多角体病毒（AcMNPV）或小鼠细小病毒（MVM）的衣壳蛋白显微注射卵母细胞后的代表性结果，并讨论了该技术的潜在应用。
方案
第1部分：用于显微注射的Xenopus卵母细胞的制备
- 取一小块（约 2 cm）Xenopus laevis 卵巢组织，放入含有 20 ml 胶原酶溶液（5 mg/ml 胶原酶溶于无钙改良 Barth 氏生理盐水：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.82 mM MgSO4、10 mM Hepes，pH 7.5）的 50 ml 锥形管中。胶原酶用于去除包裹卵母细胞的滤泡细胞。
- 将锥形管置于摇床上，轻轻振荡（100 RPM）一小时。胶原酶不同批次作用效果可能不同，因此一小时后应取少量卵母细胞在解剖显微镜下观察。充分去滤泡的卵母细胞应彼此分离良好，且易于将玻璃针插入卵母细胞内。若去滤泡不充分，则继续将其留在胶原酶溶液中，每隔五分钟检查一次。
- 用改良 Barth 氏生理盐水（MBS：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.82 mM MgSO4、0.33 mM Ca(NO3)2、0.41 mM CaCl2、10 mM Hepes，pH 7.5）清洗卵母细胞三次，并将其转移至一个直径为 100 mm 的培养皿中，皿中加入含 1% 青霉素/链霉素的 MBS。此时卵母细胞已准备好用于显微注射。若显微注射需在另一天进行，可将卵母细胞在 4 °C 下保存最多一周。
- 在解剖显微镜下挑选成熟的 VI 期卵母细胞用于显微注射。这些卵母细胞体积较大，动物极呈黑色，植物极呈乳白色，两者之间具有良好的对比度。
- 将成熟的 VI 期卵母细胞转移至微孔板（Nunc，每孔体积 10 µl）中。操作时应小心，使用 200 µl 移液器，并采用末端剪去一段的移液枪头，以确保卵母细胞能平稳吸入而不受损伤。
第2部分：Xenopus 卵母细胞的显微注射
- 准备待显微注射的导入底物，加入少量1%溴酚蓝以帮助观察显微注射过程。例如，我们在10 µl底物中加入1 µl溴酚蓝。
- 在直径100 mm的培养皿内放置一小条Parafilm，并在其上滴加5 µl待注射溶液。
- 用先前校准过的注射针（通过Inject+Matic拉针仪拉制Drummond品牌的6.6 µl玻璃毛细管制成）吸取待注射溶液。操作时将显微注射仪设为吸液模式。为校准注射针，需在针管上每0.5 mm做一标记，每个标记对应50 nl的体积。
- 进行胞质注射时，将注射针尖以约45度角插入卵母细胞的植物极区域，位置应紧邻动物极。将显微注射仪切换至注射模式，向每个卵母细胞注射50 nl的导入底物。通过观察针上的标记点来监控已注射的底物量。
- 将注射后的卵母细胞转移至盛有MBS的小型培养皿（直径35 mm）中，在室温下孵育所需时间（选择合适的时间点以观察与核孔复合体（NPCs）结合的导入底物；对于主动转运至NPC的蛋白质和病毒，通常在注射后10至30分钟内可观察到；该时间也取决于注射位点以及蛋白质或病毒的大小）。
- 孵育结束后，将卵母细胞转移至含有2%戊二醛MBS溶液的4 ml玻璃小瓶中，于4 °C固定过夜。
第3部分：Xenopus 卵母细胞的解剖
- 第二天，用 MBS 将卵母细胞清洗 3 次。
- 将卵母细胞转移至盛有低盐缓冲液（LSB：1 mM KCl、0.5 mM MgCl2、10 mM HEPES，pH 7.5）的小培养皿中。在解剖显微镜下，使用解剖镊子从每个卵母细胞中去除植物极。操作时可用一对镊子固定待解剖的卵母细胞，另一对镊子像剪刀一样切除植物极，有助于稳定操作。此时可通过细胞质中是否出现蓝色来评估显微注射是否成功。仅对显微注射成功的卵母细胞继续后续操作。此外，若样品需用于电镜制备，此解剖步骤将显著便于在修块和切片过程中定位细胞核。
- 再次用含 2% 戊二醛的 LSB 在室温下固定解剖后的卵母细胞 1 小时。
- 固定后，用 LSB 将解剖后的卵母细胞清洗 3 次。
第4部分：用于包埋和超薄切片电镜观察的显微注射卵母细胞制备
- 将解剖好的卵母细胞转移至凹面载玻片上。尽可能吸除液体，然后迅速（防止细胞干燥）用2%低熔点琼脂糖覆盖解剖好的卵母细胞。在琼脂糖仍处于软化状态时，使用移液器吸头将卵母细胞彼此分开，并确保每个卵母细胞正面朝上或朝下（而非侧向）。
- 让琼脂糖固化约10分钟。琼脂糖完全固化后，用剃刀片将琼脂糖切成小块，每块包含一个解剖好的卵母细胞。
- 将包埋在琼脂糖中的卵母细胞放入4 ml玻璃小瓶中，并在LSB中用1% OsO4于室温下后固定1小时。
- 用LSB洗涤样品三次。如有需要，可将样品在4 °C下过夜保存，并于次日继续操作。
- 依次用浓度递增的酒精进行脱水处理（50%、70%和90%乙醇，每次20分钟）。随后更换两次100%乙醇，每次15分钟。最后用100%丙酮脱水15分钟。
- 用Epon（Fluka）与丙酮按1:1比例混合液浸透样品1小时，接着用Epon与丙酮按2:1比例混合液浸透2小时，最后用纯Epon浸透至少6小时。
- 将样品置于装有新鲜纯Epon的平底包埋模具中。卵母细胞的摆放方向应使靠近注射位点的细胞核一侧——即本实验中已被解剖的一侧——优先被切片。此步骤可优化观察所选底物导入过程的概率。
- 最后，在60 °C下聚合Epon两天。
- 为观察样品，需对包埋块进行修整，然后使用超薄切片机切片。将切片转移至电镜载网上，按标准流程染色后，用透射电子显微镜观察。此部分为常规电镜操作，不再展示。
第5部分：代表性结果：
如果实验方案成功，则在透射电镜照片中应能清晰观察到核膜（NE）和核孔复合体（NPCs）。根据所注射的底物以及注射至固定之间的时间长短，底物应可见于核孔复合体的胞质面、核孔复合体内或核孔复合体的核内面。
图1显示了一个包含相邻细胞质（c）和细胞核（n）的东北向截面 非洲爪蟾 注射了杆状病毒AcMNPV衣壳的卵母细胞，在以下条件下孵育： 4°C 孵育四小时后，按所述方法进行包埋并制备超薄切片用于电镜观察。箭头指示核孔复合体（NPCs）。白色箭头指示一个衣壳正在与NPC的细胞质侧结合。
相比之下，图2显示了注射了鼠细小病毒（MVM）的Xenopus卵母细胞的核膜（NE）横切面，其中包含相邻的细胞质（c）和细胞核（n）。该样本在室温下孵育4小时后，按所述方法进行包埋和超薄切片电镜制样。利用该技术，我们发现MVM可诱导核膜（NE）结构的破坏（Cohen和Panté，2005）。方括号标示核膜上的断裂区域，箭头指示核孔复合体（NPCs），与核膜相关的疑似MVM衣壳由白色箭头标出。
图1：来自注射了杆状病毒 AcMNPV 衣壳的 Xenopus 卵母细胞的核膜（NE）横截面透射电镜图，图中可见相邻的细胞质（c）和细胞核（n）。样品在 4°C 下孵育 4 小时，随后按所述方法进行包埋和超薄切片电镜制样。箭头指示核孔复合体（NPCs），白色箭头指示衣壳。比例尺：100 nm。
图2：来自注射了鼠细小病毒（MVM）的Xenopus卵母细胞的核膜（NE）横截面透射电镜图，细胞质（c）和细胞核（n）相邻。该样品在室温下孵育4小时，随后按所述方法进行包埋和超薄切片电镜制样。箭头指示核孔复合体（NPCs）；方括号标示核膜上的断裂区域；白色箭头指示与核膜相关联的疑似MVM衣壳。比例尺：100 nm。
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讨论
将显微注射技术与超薄切片电镜技术相结合，用于研究非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中的核质运输，是一种极为有效的实验体系。该系统已被用于解析通过核孔复合体（NPC）进行核输入的各个独立步骤，例如核输入底物与核孔复合体结构组分（如胞质丝状结构和核篮）之间的相互作用（参见Panté，2006年的综述）。此外，该体系还被用于研究在细胞核内复制的病毒的核输入过程（Panté 和 Kann，2002；Rabe et al.，2003；Cohen 和 Panté，2005）。
此处展示的细胞质显微注射技术的一种变体是核输出底物的核内显微注射（Panté et al.，1997）。进行核注射时，需将卵母细胞置于微孔板中，调整方向使动物极朝上，并在4 °C下孵育过夜。次日，细胞核应可见为动物极区域略微隆起的部分。以较陡的角度（大于45度）向细胞核内显微注射约25 nl的输出底物，随后按照本文所述方法进行包埋和超薄切片电镜分析。
还需要注意的是，在处理电子显微镜下无法直接观察的转运底物时，通...
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致谢
我们感谢 David Theilmann（不列颠哥伦比亚省萨默兰太平洋农业与食品研究中心）提供杆状病毒 AcMNPV 以及富有建设性的讨论。
本工作获得了加拿大创新基金会（CFI）、加拿大卫生研究院（CIHR）、迈克尔·史密斯健康研究基金会（MSFHR）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的资助。
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参考文献
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).
- Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).
- Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).
- Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
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