非洲爪蟾卵母细胞的显微注射

摘要

本文演示了将核输入底物进行细胞质显微注射至Xenopus laevis卵母细胞中的操作，以及对注射后的卵母细胞进行超薄切片电子显微镜观察的样品制备方法。

摘要

对Xenopus laevis卵母细胞进行显微注射，随后进行超薄切片电子显微镜（EM）观察，是研究核质运输的优良体系。由于其细胞核体积大且核孔复合体（NPCs）密度高，核转运过程在Xenopus卵母细胞中易于观察。通过该体系，研究人员已深入了解了核输入与核输出的多种机制（参见Panté, 2006年的综述）。此外，我们还利用Xenopus卵母细胞的显微注射技术，解析了多种在宿主细胞核内复制的病毒的核输入途径。

本文演示了将核转运底物进行细胞质显微注射至Xenopus卵母细胞的操作方法。同时展示了注射后卵母细胞的制备步骤，以便通过超薄切片电镜进行观察，包括卵母细胞的解剖、脱水以及包埋于环氧树脂中的过程。最后，我们提供了用杆状病毒Autographa californica核多角体病毒（AcMNPV）或小鼠细小病毒（MVM）的衣壳蛋白显微注射卵母细胞后的代表性结果，并讨论了该技术的潜在应用。

方案

第1部分：用于显微注射的Xenopus卵母细胞的制备

1. 取一小块（约 2 cm）Xenopus laevis 卵巢组织，放入含有 20 ml 胶原酶溶液（5 mg/ml 胶原酶溶于无钙改良 Barth 氏生理盐水：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.82 mM MgSO₄、10 mM Hepes，pH 7.5）的 50 ml 锥形管中。胶原酶用于去除包裹卵母细胞的滤泡细胞。
2. 将锥形管置于摇床上，轻轻振荡（100 RPM）一小时。胶原酶不同批次作用效果可能不同，因此一小时后应取少量卵母细胞在解剖显微镜下观察。充分去滤泡的卵母细胞应彼此分离良好，且易于将玻璃针插入卵母细胞内。若去滤泡不充分，则继续将其留在胶原酶溶液中，每隔五分钟检查一次。
3. 用改良 Barth 氏生理盐水（MBS：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.82 mM MgSO₄、0.33 mM Ca(NO₃)₂、0.41 mM CaCl₂、10 mM Hepes，pH 7.5）清洗卵母细胞三次，并将其转移至一个直径为 100 mm 的培养皿中，皿中加入含 1% 青霉素/链霉素的 MBS。此时卵母细胞已准备好用于显微注射。若显微注射需在另一天进行，可将卵母细胞在 4 °C 下保存最多一周。
4. 在解剖显微镜下挑选成熟的 VI 期卵母细胞用于显....

讨论

将显微注射技术与超薄切片电镜技术相结合，用于研究非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中的核质运输，是一种极为有效的实验体系。该系统已被用于解析通过核孔复合体（NPC）进行核输入的各个独立步骤，例如核输入底物与核孔复合体结构组分（如胞质丝状结构和核篮）之间的相互作用（参见Panté，2006年的综述）。此外，该体系还被用于研究在细胞核内复制的病毒的核输入过程（Panté 和 Kann，2002；Rabe et al.，2003；Cohen 和 Panté，2005）。

此处展示的细胞质显微注射技术的一种变体是核输出底物的核内显微注射（Panté et al.，1997）。进行核注射时，需将卵母细胞置于微孔板中，调整方向使动物极朝上，并在4 °C下孵育过夜。次日，细胞核应可见为动物极区域略微隆起的部分。以较陡的角度（大于45度）向细胞核内显微注射约25 nl的输出底物，随后按照本文所述方法进行包埋和超薄切片电镜分析。

还需要注意的是，在处理电子显微镜下无法直接观察的转运底物时，通.......