显微注射mRNA和斑马鱼的胚胎吗啉反义寡核苷酸。

摘要

显微注射是外来物质引入斑马鱼胚胎受精的完善而有效的方法。在这里，我们展示了一个强大的执行mRNA表达显微注射技术，和吗啉代寡核苷酸在斑马鱼的基因敲除研究。

摘要

调查在开发过程中的一个基因的作用的一个必不可少的工具，来进行基因敲除，的过度表达，和错误表达研究的能力。在斑马鱼（

方案

第1部分:微量制备，显微注射室板

1. 编造加热和拉​​在微量拉拔设备的高硼硅玻璃毛细管（世界精密仪器公司，1B100 - 4）（萨特仪器公司，火焰山/布朗的P - 97）的微量。在培养皿中少量的粘土或胶带上的商店。
2. 1X E3媒体与楔形槽，将成为一个简单的方法（如"斑马鱼书"中描述的）在注射胚胎成型板，倒在1.5％琼脂糖（美国Bioanlytical公司，AB00972 - 00500）让琼脂室板之前，使用和储存在4℃固化。

第2部分:RNA的制备

基因功能研究的一个强大的方法是microinject在体外转录的斑马鱼胚胎的上限RNA。有回报上限的RNA的行为同样由于存在第模拟体内发现的真核细胞的mRNA。斑马鱼的研究人员经常利用这种方法，他们感兴趣的基因过表达或misexpress。在这个演示中，我们将microinject EGFP标记的成绩单和使用作为一个成功的注射可见读数的活全胚胎GFP的表达。

1. 执行体外转录反应第RNA对您感兴趣的成绩单。在我们的实验室中，我们经常插入一个pCS2 +矢量利益的cDNA，并执行在体外大量使用mMessage mMachine SP6套件（Ambion公司，股份有限公司，AM1340）的上限核糖核酸的合成反应。
2. 纯化的RNA样品....

讨论

微量注射到斑马鱼的胚胎是一个探索发展的一个特定基因的作用以及建立和强大的技术。应用范围包括过度表达，错误表达，和您的利益，以及多个基因之间的互作分析的基因敲除实验。微量注射在斑马鱼已被广泛用于产生转基因动物，和映射^在 5,6,7,8,9囊胚早期胚胎细胞的命运。此外，这项技术的应用作为一个细胞移植^方法 10种系嵌合体的关键一步。

一个替代方法，为探索基因的"增益功能"表型，是microinject该基因的活性形式。此外，一个基因的伪"丧失功能的表型，可以探索注射该基因的显性负形式。微量注射到斑马鱼的胚胎也可能包括DNA和小^分子 11,12 。

在这显微注射技术的一个关键的一步是微量针的质量。我们从我们的微量毛细管状吸管拉拔设备。重要的是，吸管车夫是正确校准，以产生最佳的针头的形状和大小。微量移液器，过于长而窄，往往缺乏刚性，容易折断和斗争，渗透到蛋壳和蛋黄。短微量往往更容易损坏胚胎显微注射过程中的。

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材料