显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。
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摘要
摘要
研究基因在发育过程中作用的一项重要工具是能够进行基因敲低、过表达和异位表达研究。在斑马鱼（Danio rerio)，将RNA、DNA、蛋白质、反义寡核苷酸及其他小分子显微注射到发育中的胚胎中，为研究人员提供了一种快速且可靠的基因功能研究方法in vivo. 在本视频文章中，我们将演示如何准备并进行显微注射in vitro合成的 EGFP mRNA 和针对翻译的阻断型吗啉代寡核苷酸pkd2，一种与常染色体显性多囊肾病（ADPKD）相关的基因，导入单细胞期斑马鱼胚胎中。随后，我们将通过验证GFP表达和表型分析来评估mRNA和吗啉代寡核苷酸显微注射的成功率。该技术的广泛应用包括转基因动物和生殖系嵌合体的生成、细胞命运图谱绘制以及基因筛选。本文中，我们描述了一种EGFP过表达和基因敲降的实验方案pkd2通过 mRNA 和吗啉代寡核苷酸注射。
方案
第1部分：微移液管和显微注射室板的制备
- 使用微电极拉制仪（Sutter Instruments Inc.，Flaming/Brown P-97）加热并拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（World Precision Instruments, Inc.，1B100-4）以制备微电极。将制备好的微电极存放于培养皿中，置于少量黏土或胶带上。
- 在1x E3培养基平板中倒入1.5%琼脂糖（American Bioanlytical, Inc.，AB00972-00500），平板预先模制成楔形槽，便于在注射过程中固定胚胎（如《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book）中所述）1。使用前让琼脂糖模具平板凝固，并于4ºC保存。
第二部分：RNA 的制备
研究基因功能的一种有力方法是在斑马鱼胚胎中显微注射体外转录的带帽RNA。in vitro合成的带帽RNA由于含有CAP类似物，其行为与体内存在的真核mRNA相似。斑马鱼研究人员 routinely 采用该方法来过表达或异位表达其目标基因。在本实验演示中，我们将显微注射一段EGFP标记的转录本，并以活体胚胎中GFP的表达作为注射成功的可视读出信号。
- 执行 体外 对目标转录本进行加帽RNA转录反应。在我们的实验室中，通常将目标cDNA插入pCS2+载体中，并进行以下操作 体外 使用 mMessage mMachine SP6 试剂盒（Ambion, Inc., AM1340）合成大量加帽RNA。
- 使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen, Inc., 74104）纯化RNA样品，或采用苯酚:氯仿抽提结合异丙醇沉淀法进行纯化。
- 仔细确定RNA样品的浓度，并于-80ºC保存，直至使用。
- 注射当天，将RNA样品解冻，轻轻涡旋振荡，然后短暂离心。
- 用无菌水配制终浓度为 0.025–0.050% 的酚红（Sigma-Aldrich Co., P0290）工作液。酚红用于在胚胎注射过程中直观标记溶液的注入情况。本文中，我们将配制含 0.050% 酚红的 100 ng/μL EGFP mRNA 工作液。
- 保持样品置于冰上操作，并将RNA储备液放回-80℃80°C.
- 准备就绪后，进入第4部分以注射该样品。
第3部分：吗啉代寡核苷酸的制备
吗啉代反义寡核苷酸被广泛用于通过阻断靶向蛋白的翻译或修饰前体mRNA剪接来调控基因表达2,3。在斑马鱼中，吗啉代是一种强大的反向遗传学工具，可通过抑制基因功能实现研究目的。本文中，我们将显微注射一种靶向pkd2基因翻译起始位点的吗啉代寡核苷酸（5′-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3′）。根据先前已建立的研究结果，我们预期注射后的胚胎将表现出类似于pkd2突变体鱼的表型4。
- 我们通常从 Gene Tools, LLC（Philomath, OR）订购 300 nmol 针对目标基因特异性设计的吗啉代寡核苷酸（morpholino oligo）。
- 加入 100 µL 无菌水，配制成 3 mM 的储存液。分装后于 -20°C 保存，直至使用。
- 在注射当天，将吗啉代溶液在 65°C 加热 5 分钟，立即置于冰上快速冷却，并短暂离心。此步骤可消除寡核苷酸中的二级结构，确保溶液完全溶解。
- 通过将吗啉代溶液用无菌水稀释，并加入终浓度为 0.025–0.050% 的酚红，配制工作液。在本示例中，我们将配制含有 0.050% 酚红的 0.50 mM pkd2 吗啉代工作液。
- 工作液于室温保存。
- 准备注射该样品时，进入第 4 部分操作。----
第4部分：用工作溶液填充微量移液器
- 使用镊子或手术刀片切割微量移液器的远端尖端，以形成一个在解剖显微镜（Nikon Instruments, Inc., SM2645）50倍放大下刚好可见的开口。
- 将2 µL的工作液作为液滴置于盖玻片上。
- 将微量移液器尾部连接至装有导管的5 mL注射器（连接皮下注射针头），并将微量移液器的远端尖端轻轻浸入工作液滴中。注意避免损坏移液器尖端。
- 通过拉动注射器活塞，使工作液从微量移液器的远端吸入。
第5部分：校准微量移液器注射体积
- 在载物台微米尺（Fisher, 12-561-SM1）上滴加一滴矿物油（American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025）。
- 打开压力脉冲式显微注射仪（World Precision Instruments Inc., PV830）的电源和气源。
- 将微量移液管连接至显微注射仪的移液管固定装置。该显微注射仪由压力调节控制，通过踩下脚踏开关启动液体释放。
- 在解剖显微镜下，使用显微注射仪将工作液滴加至微米尺油滴中，以测试注射体积。测量液滴在油面上呈球形漂浮时的直径。
- 调节注射的压力和持续时间，精确校准每次注射的体积。此步骤有助于提高显微注射实验的可重复性。在本示例中，所有显微注射均使用直径为 0.15 mm 的液滴（体积约为 1.76 nL）。
- 完成注射体积校准后，使用显微注射仪上的“Hold”旋钮防止微量移液管回流或泄漏。
第6部分：制备受精斑马鱼胚胎以进行显微注射
- 斑马鱼通常在每天清晨的最初几个小时内随机交配。在单细胞阶段收集胚胎，并将其置于1x E3培养基中。
- 使用3 mL移液管（Becton Dickinson Labware, 357524），将胚胎沿显微注射板上的楔形槽排列。
- 移除培养基，使胚胎仅浅层浸没而不被淹没。此步骤有助于胚胎沉降至槽底，并利于微针穿透卵膜。
第7部分：通过绒毛膜进行显微注射
- 使用显微注射针操纵胚胎，使1细胞期胚胎的细胞质在解剖显微镜下可见。注意避免损坏显微注射针的尖端。
- 用显微注射针穿透卵膜，随后穿透卵黄，以向胚胎内注射。在本演示中，我们将首先将工作液直接注射到细胞下方的卵黄中，并依靠细胞质流动和扩散使工作液进入细胞。由于工作液中添加了酚红，该流动过程可见。
- 我们还将演示直接向细胞质内注射的方法。直接显微注射入细胞更为有效，但耗时较长，因其需要精确的胚胎定位和显微注射技术。由于细胞膜比卵黄膜更坚韧，通常通过卵黄插入显微注射针以进入细胞质更为快捷。将胚胎的动物极朝向槽底，并保持手部稳定操作，有助于实现此种注射方法。
- 显微注射后，将胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中，并在28.5°C条件下孵育，以支持正常发育。
- 在随后数小时至数天的胚胎发育过程中，观察胚胎所出现的目标表型。
第8部分：代表性结果
EGFP mRNA过表达：为验证显微注射的成功，我们将从盾牌期（约6 hpf）开始监测发育中胚胎的GFP表达情况 体内 全胚胎荧光显微镜观察（Leica Microsystems GmBh，MZFLIII）。该表达载体在胚胎发育早期事件中表达最强，随着注射的加帽RNA逐渐降解以及表达蛋白的稳定性不同，其表达水平在后续发育过程中通常会减弱。
pkd2 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸：根据先前发表的研究结果，我们预期pkd2 吗啉代寡核苷酸敲降胚胎会表现出与pkd2 突变型斑马鱼相似的躯体背侧轴弯曲，并在约2至3天后出现肾囊肿4。
图1： 显微注射EGFP mRNA后的代表性结果 pkd2 AUG 形态学反义寡核苷酸。(a) 在1细胞期向TAB胚胎显微注射0.17 ng EGFP mRNA，并在受精后1天观察荧光表达情况 体内 GFP表达。(b,c) 在1细胞期，向TAB胚胎显微注射约1.7 nl的 pkd2 0.50 mM 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸处理，并在4 dpf时观察背部弯曲情况。
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讨论
对斑马鱼胚胎进行显微注射是一种成熟且可靠的技术，可用于研究特定基因在发育过程中的作用。该技术的应用包括目的基因的过表达、异位表达和基因敲低检测，以及多个基因之间的上位性分析。斑马鱼显微注射已被广泛用于转基因动物的构建，以及早期囊胚胚胎中的细胞命运图谱绘制5,6,7,8,9。此外，该技术在通过细胞移植方法构建生殖系嵌合体的过程中也起着关键作用10。
研究基因“功能获得”表型的一种替代方法是显微注射该基因的组成型活性形式。此外，通过显微注射该基因的显性负性形式，可探索其模拟的“功能缺失”表型。对斑马鱼胚胎的显微注射还可包括DNA和小分子11,12。
该显微注射技术的关键步骤之一是微吸管针头的质量。我们使用拉针仪将毛细管拉制成微吸管。确保拉针仪经过适当校准，以获得最佳的针头形状和尺寸至关重要。过长且过细的微吸管通常缺乏刚性，容易断裂，并难以穿透卵膜和卵黄。而过短的微吸管在显微注射过程中则更容易损伤胚胎。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）和多囊肾病基金会（PKD foundation）对ZS的资助。所有动物实验均按照耶鲁大学动物资源中心（YARC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指南进行。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 培养基 | 试剂 | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO₄2 0.1% 亚甲蓝 | ||
| 所有其他材料均列于方案中。 |
参考文献
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重印与许可
