斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

摘要

显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。

摘要

研究基因在发育过程中作用的一项重要工具是能够进行基因敲低、过表达和异位表达研究。在斑马鱼（Danio rerio)，将RNA、DNA、蛋白质、反义寡核苷酸及其他小分子显微注射到发育中的胚胎中，为研究人员提供了一种快速且可靠的基因功能研究方法in vivo. 在本视频文章中，我们将演示如何准备并进行显微注射in vitro合成的 EGFP mRNA 和针对翻译的阻断型吗啉代寡核苷酸pkd2，一种与常染色体显性多囊肾病（ADPKD）相关的基因，导入单细胞期斑马鱼胚胎中。随后，我们将通过验证GFP表达和表型分析来评估mRNA和吗啉代寡核苷酸显微注射的成功率。该技术的广泛应用包括转基因动物和生殖系嵌合体的生成、细胞命运图谱绘制以及基因筛选。本文中，我们描述了一种EGFP过表达和基因敲降的实验方案pkd2通过 mRNA 和吗啉代寡核苷酸注射。

方案

第1部分：微移液管和显微注射室板的制备

1. 使用微电极拉制仪（Sutter Instruments Inc.，Flaming/Brown P-97）加热并拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（World Precision Instruments, Inc.，1B100-4）以制备微电极。将制备好的微电极存放于培养皿中，置于少量黏土或胶带上。
2. 在1x E3培养基平板中倒入1.5%琼脂糖（American Bioanlytical, Inc.，AB00972-00500），平板预先模制成楔形槽，便于在注射过程中固定胚胎（如《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book）中所述）¹。使用前让琼脂糖模具平板凝固，并于4ºC保存。

第二部分：RNA 的制备

研究基因功能的一种有力方法是在斑马鱼胚胎中显微注射体外转录的带帽RNA。in vitro合成的带帽RNA由于含有CAP类似物，其行为与体内存在的真核mRNA相似。斑马鱼研究人员 routinely 采用该方法来过表达或异位表达其目标基因。在本实验演示中，我们将显微注射一段EGFP标记的转录本，并以活体胚胎中GFP的表达作为注射成功的可视读出信号。

1. 执行 体外 对目标转录本进行加帽RNA转录反应。在我们的实验室中，通常将目标cDNA插....

讨论

对斑马鱼胚胎进行显微注射是一种成熟且可靠的技术，可用于研究特定基因在发育过程中的作用。该技术的应用包括目的基因的过表达、异位表达和基因敲低检测，以及多个基因之间的上位性分析。斑马鱼显微注射已被广泛用于转基因动物的构建，以及早期囊胚胚胎中的细胞命运图谱绘制^5,6,7,8,9。此外，该技术在通过细胞移植方法构建生殖系嵌合体的过程中也起着关键作用¹⁰。

研究基因“功能获得”表型的一种替代方法是显微注射该基因的组成型活性形式。此外，通过显微注射该基因的显性负性形式，可探索其模拟的“功能缺失”表型。对斑马鱼胚胎的显微注射还可包括DNA和小分子^11,12。

该显微注射技术的关键步骤之一是微吸管针头的质量。我们使用拉针仪将毛细管拉制成微吸管。确保拉针仪经过适当校准，以获得最佳的针头形状和尺寸至关重要。过长且过细的微吸管通常缺乏刚性，容易断裂，并难以穿透卵膜和卵黄。而过短的微吸管在显微注射过程中则更容易损伤胚胎。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x E3 培养基	试剂			5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO₄2 0.1% 亚甲蓝
所有其他材料均列于方案中。