显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

摘要

本视频展示了如何在单细胞阶段将吗啉代寡核苷酸（morpholino）或 mRNA 注射到斑马鱼胚胎中，以在后续发育过程中降低或增加特定基因产物的水平。

摘要

斑马鱼研究的优势之一在于能够便捷快速地操控胚胎中的蛋白质水平。可通过向胚胎中添加吗啉代寡核苷酸（Morpholino）来降低特定基因产物的表达水平，这类合成寡核苷酸具有与靶标RNA互补的反义序列。相反，也可向胚胎中引入加工后的mRNA以提高特定基因产物的含量。将mRNA或吗啉代寡核苷酸导入胚胎的常用方法是显微注射。显微注射效率高、速度快，每小时可注射数百枚胚胎。本视频展示了显微注射的全部操作步骤。简要而言，胚胎产下后需立即收集，并在培养皿中沿显微镜载玻片排成一行。随后，将装有注射物质的细尖针头连接至显微注射仪和气源，并调节显微注射仪的控制参数，以获得理想的注射体积。最后，将针头插入胚胎卵黄，注入吗啉代寡核苷酸或mRNA。 关键词：斑马鱼，胚胎，显微注射，吗啉代寡核苷酸，mRNA，基因表达调控，卵黄注射

方案

第1部分：卵的产生与收集

1. 注射前一晚，在繁殖用培养皿中设置好斑马鱼，并放置隔离板。如需提高总产卵量，可根据需要按两条雌鱼配一条雄鱼的比例进行设置。
2. 次日早晨，在实验室灯光开启后，移除多个培养皿中的隔离板，让鱼自由交配约20分钟。
3. 使用滤网从繁殖装置中收集卵子，并用卵水冲洗。将卵子倒入盛有卵水的培养皿中，用移液管去除未受精的卵和杂质。可将鱼重新组合放入较大的培养缸中，以产生更多可用于注射的卵。调整收卵时间，以获得最大数量的卵，同时确保卵未超过单细胞阶段。
4. 将一块载玻片置于直径100 mm培养皿的倒置皿盖内。用移液管将卵沿载玻片边缘排成单列。用擦拭纸（Kimwipe）紧贴卵的对侧，吸去载玻片上多余的卵水。（图1A）

第二部分：玻璃微电极的拉制、装载与准备

1. 使用显微拉针仪将一根外径为1.0 mm的玻璃毛细管拉制成两根针头，并将其放置在150 mm的培养皿中，针头架在橡皮泥制成的斜坡上保存。针头可预先制备。
2. 使用微量移液器向针头后部加载3 μL注射材料。轻轻震荡，使液团移向针尖，直至残留气泡极少或完全消失。
3. 打开气源和显微注射仪。将针头插入显微注射仪中，确保其在固定座内形成紧密密封。检查显微操作仪是否处于合适位置，以保证有足够的移动和调节范围。将针尖移至显微镜视野平面，位置略高于载物台，聚焦于针尖最细的区域。使用一对尖头镊子在适当位置夹断针尖，使针头足够细，能够穿透卵膜和卵黄，同时仍能稳定地释放出一致体积的液滴。可在千分尺上滴加一滴矿物油，用于计算每次注射的体积。当液滴注入油中时，直径为0.1 mm的液珠含有500 pL注射材料（图1B）；通常使用的注射体积为500 pL或1 nL。踩下脚踏开关，在修剪针尖的同时观察液滴大小，并根据需要调节注射压力。理想的注射体积约为卵体积的10%。针尖的质量对于注射操作的难易程度以及实验结果的质量和重复性至关重要。

第3部分：注射

1. 确保胚胎尚未发育超过四细胞期，理想情况下应处于单细胞期。
2. 将注射针向下移动至卵列上方，同时用另一只手固定培养皿。
3. 在观察卵黄囊是否受压破裂或撕裂的情况下，用平稳的动作刺穿卵膜并进入卵黄。将注射物质注入卵黄中（图1C）。避免注入气泡或拉伸卵黄，因为这两种情况均可能导致胚胎死亡。沿卵列依次操作时，根据需要调节压力以保持液滴大小一致，并使用移液器吸头移除未受精或在注射过程中受损的卵。
4. 完成一列卵的注射后，用轻柔的卵水水流将已注射的卵转移至洁净的培养皿中。根据需要重复此操作。保留若干未注射的胚胎作为对照。在第一天结束时，清除死亡胚胎并记录已注射胚胎的数量。定期更换培养皿中的卵水，以降低感染风险。

第4部分：代表性结果

根据所注射物质的不同，胚胎的存活率可能低于未注射的同胞。幸运的是，可以轻松注射大量胚胎，因此这通常不会成为问题。形态缺陷型胚胎出现轻微的发育延迟是正常现象。

为了展示显微注射的结果，我们采用本方案调控心脏玻璃蛋白（Heart of Glass, Heg）的表达水平。Heg 是一种跨膜蛋白，对正常心脏发育至关重要。在缺失该蛋白的情况下，胚胎会发育出巨大的流入道和心腔¹。我们注射了两种此前未见报道的针对heg基因的吗啉代寡核苷酸（morpholino），即 heg_e3i3_egfr1 和 heg_e4i4_egfr2，浓度为 500 μM。受精后两天，未注射的同胞对照组胚胎表现正常，符合预期（图 2A 和 B）。注射了 heg_e3i3_egfr1 的胚胎出现脑水肿（图 2C）。尽管这些形态缺陷胚胎的大部分心脏形态发生改变，但其心腔大小正常（图 2D）。注射 heg_e4i4_egfr2 的胚胎表现出不同程度的心脏畸形：部分胚胎外观正常，而另一些则具有较大的流入道和中度扩张的心房（图 2E 和 F）。如先前报道¹所示，heg 突变体具有显著扩大的流入道和心房（图 2G 和 H）。

我们还向野生型胚胎注射了由全长heg cDNA转录而来的400 ng/μL mRNA。未注射的对照组胚胎发育正常（图3A和B），而注射了heg mRNA的胚胎则表现出一系列表型，从外观接近野生型到严重的独眼畸形、主轴缩短、头颈部及身体坏死以及中线结构缺陷不等（图3C和D）。

图1. 待注射的胚胎在培养皿中沿显微镜载玻片排列整齐（A）。通过将液体注射至置于千分尺上的矿物油中来确定注射体积。常用的500 pL注射体积，其液滴直径为0.1 mm（B）。注射后立即可在卵黄中观察到形态抑制寡核苷酸（morpholino）或mRNA呈点状斑点（C）。

图2. 在受精后2天，未注射的胚胎无明显畸形（A）或心脏表型异常（B）。注射了靶向heg_e3i3_egfr1的吗啉代寡核苷酸的胚胎出现脑水肿（C，箭头所示），但心室大小正常（D）。部分注射了靶向heg_e4i4_egfr2的吗啉代寡核苷酸的胚胎表现出流入道和心房扩大（E，F）。heg突变体胚胎的流入道和心房显著扩大（G，H）。（A）、（C）、（E）和（G）为4倍微分干涉差（DIC）图像；（B）、（D）、（F）和（H）为20倍DIC图像。a=心房，it=流入道。

图3. 受精后24小时，未注射的胚胎具有细长且笔直的身体，无坏死或中线缺陷（A），并具有两个清晰定义的眼睛以及其间发育良好的神经管（B）。相比之下，部分注射heg mRNA的胚胎则表现出体轴缩短、坏死、体节形态异常（C）以及独眼畸形（D）。（A）和（C）为4倍微分干涉差（DIC）图像；（B）和（D）为20倍微分干涉差（DIC）图像。

讨论

斑马鱼模型系统的一个优势在于能够通过显微注射轻松地向胚胎中添加或去除特定的基因产物。为了在全身范围内过表达某种特定蛋白，可将编码该蛋白的 mRNA 在单细胞阶段注射到卵黄中。在胚胎随后的发育过程中，该 RNA 会分布至整个生物体并被翻译。相反，若要消除某种特定蛋白，则可使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）。吗啉代寡核苷酸是一类合成的寡核苷酸，其设计基于与特定 RNA 序列互补的反义序列。与 mRNA 类似，吗啉代寡核苷酸也在单细胞阶段被注射到卵黄中。进入胚胎后，它们会结合靶标 RNA，从而阻止其翻译。

针对每种吗啉代寡核苷酸（morpholino）或mRNA，所需进行的主要调整是注射材料的浓度。吗啉代寡核苷酸或mRNA的浓度过高均可能导致非特异性毒性；虽然每种吗啉代寡核苷酸都必须通过实验经验确定其最佳浓度，但通常在200 μM至500 μM之间的浓度范围内，可有效抑制基因活性，同时不会引起非特异性缺陷。针头开口的精确尺寸并不关键。在一定范围的针头尺寸内，可通过调节注射压力和注射时间，获得正确体积的注射剂量。

Morpholino 具有多种应用，包括对蛋白质内特定功能域进行功能解析。当设计用于靶向特定的外显子-内含子连接区时，Morpholino 可阻止该位点的剪接过程。我们研究了两种结合 heg 前体 mRNA 中外显子-内含子连接区的 Morpholino 的效应。Morpholino heg_e3i3_egfr1 结合外显子 3 与内含子 3 之间的连接区，阻止剪接机制将外显子 3 整合到成熟转录本中；Morpholino heg_e4i4_egfr2 以类似方式剔除外显子 4。外显子 3 和外显子 4 均编码包含 EGF 样重复序列的结构域。部分注射 heg_e4i4_egfr2 的胚胎表现出与突变体中度相似的表型；尚需进一步实验以明确 Heg 外显子 4 在心脏发育中的作用。出乎意料的是，注射 heg_e3i3_egfr1 的胚胎出现脑水肿，这一特征在 heg 突变体中并未观察到。这可能是由于 Morpholino 能够结合母源转录本，而这些转录本在合子突变体中不受影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微注射仪	工具	Harvard Apparatus	PLI 100
显微操作器	工具	Narishige International	MN 153
玻璃微针拉制仪	工具	Sutter Instrument Co.	P 97
玻璃毛细管	工具	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
微量移液吸头	工具	Eppendorf	5242956.003
微针夹持器	工具	World Precision Instruments, Inc.	MPH310