获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍采用改良自动化方法进行人胰腺胰岛分离的操作流程（第一部分：胰腺组织的消化与收集）。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
1型糖尿病的管理对个人和社会而言都是一项沉重的负担，每年耗资超过1000亿美元。尽管血糖监测和新型胰岛素制剂已广泛应用，许多患者仍会出现严重的继发性并发症。胰岛移植能够恢复糖尿病患者的近似正常血糖控制1，且无须承担强化胰岛素治疗所伴随的严重低血糖发作风险。提供足够的胰岛组织量对于成功的胰岛移植至关重要。然而，供体特征、器官获取及保存过程均会影响胰岛分离的效果2. 在芝加哥伊利诺伊大学（UIC），我们开发了一种成功的分离方案，并优化了纯化梯度3该项目始于2004年1月，截至2008年11月已完成了300多次分离。胰腺组织以低温保存液（UW，威斯康星大学液或HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液）运送4-7送往伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）的细胞分离实验室进行胰岛分离。胰岛采用UIC方法进行分离，该方法是Ricordi最初描述的方法的改良版本。等 8. 简而言之，在清除胰腺周围组织后，使用酶溶液（Serva 胶原酶 + 中性蛋白酶或 Sigma V 酶）对胰腺进行灌注。膨胀的胰腺随后被转移至 Ricordi 消化室，连接至改良的封闭循环管路系统，并升温至 37°C。消化过程中，轻轻振荡消化室。持续取样以监测消化进程。一旦在显微镜下观察到游离胰岛，即通过向循环系统中灌注冷的（4°C）RPMI 稀释液（Mediatech，Herndon，VA）以稀释酶液，从而终止消化。组织经 M199 培养基（添加人血清白蛋白）收集并洗涤后，取样进行纯化前计数，并在纯化前与 UW 溶液共同孵育。纯化过程将在第二部分：人胰岛的纯化与培养中详细描述。
方案
1. 实验室设置
- 人胰岛分离是一项时间敏感的程序，需要团队合作，因此需要四人共同完成该操作。团队由外科医生领导，负责解剖并插管胰腺。
- 胰岛分离程序从团队进入UIC胰岛分离设施的那一刻即开始。团队成员需确保所有必要的仪器（如离心机）均已检查并开启，同时对所有生物安全柜及操作台面进行消毒。
- 两人负责准备插管操作台、冰沙机、消化回路、灌注装置、COBE纯化仪以及手术台。
- 与此同时，另外两名团队成员将配制分离过程中所需的各种培养基。
- 接下来，准备细菌培养管（瓶、管、表格和袋）、取样管（预装洗涤液）以及评估用试管和培养皿。
- 按以下方式准备纯化管组：第1根试管保持空置，并在150 ml处做标记；第2至第12根试管各加入200 ml添加人血清白蛋白的M199培养基（洗涤液），并在230 ml处做标记；最后准备一个50 ml锥形管，加入50 ml洗涤液。完成上述准备工作后，即可开始胰腺的准备与灌注操作。
2. 胰腺制备与灌注
- 开始胰腺的制备与灌注时，操作人员需采用无菌技术将器官从包装中取出。外科医生将胰腺转移至去污染台。
- 外科医生使用60 ml注射器抽取原始胰腺保存液，并交给操作人员，由其用于填充已准备好的“获取”用细菌培养瓶。
- 经肉眼检查评估器官是否适合进行胰岛分离（若胰腺在获取过程中受损或解剖结构异常，则不可用于胰岛分离）后，外科医生将要求操作人员准备胶原酶。请注意，不同品牌和批次的酶其重悬时间可能有所不同。
- 当外科医生准备就绪后，将去污染溶液（碘伏、制霉菌素/头孢唑林和HBSS）送至去污染台，并倒入相应的容器中。外科医生依次将胰腺在每种去污染溶液中洗涤约一分钟。随后将胰腺放入一个小的无菌广口瓶中称重。记录重量后，将胰腺置于含有保存液的插管盘中。
- 外科医生暴露主胰管并进行部分切开，使用套管对胰腺的两半分别进行插管，并用缝线固定套管。进行胰腺灌注时，先将胰腺转移至灌注装置，然后将酶溶液倒入灌注槽中。总灌注时间约为10分钟，前5分钟压力为80 mmHg，后5分钟为180 mmHg。灌注后胰腺明显膨胀。
- 将灌注完成的胰腺转移至插管盘，仔细修剪去除脂肪组织。随后将胰腺切成10–12块，并转移至Ricordi消化室进行消化。
3. 胰腺消化
- 开始消化步骤时，将胰腺转移至空的Ricordi消化室中，加入一支2.5 ml的Pulmozyme，将组织置于筛网上（避免大块组织堵塞消化室），关闭消化室，并灌注系统。
- 开始泵入溶液，持续5分钟。轻轻摇动孵育 chamber，使温热的溶液均匀分布。五分钟后，在整个消化阶段轻轻振荡 chamber。保持温度为37˚C。
- 轻轻摇动消化室直至温度达到37°，然后振荡消化室。每两分钟取样一次，镜下观察是否有游离的胰岛。将胰岛评估信息记录在批次记录的消化表格中。持续监测胰岛的游离百分比，直至溶液中游离且孤立的胰岛达到50%。
4. 组织采集
- 当样本中约有50%的胰岛已游离时，向循环系统中加入冷的RPMI稀释液以终止消化。将组织收集至预先加入30 ml人血清白蛋白的500 ml锥形管中。离心后吸除上清液，并用冷洗涤液清洗沉淀。在4˚C条件下，以1100 RPM（每分钟转数）离心1分钟。
- 将所有含有已消化胰腺组织的收集管合并至一个500 ml锥形管中。当某管中洗涤后的组织装满时，进行离心并重复洗涤过程，直至所有组织均被多次洗涤。将该管离心后，将组织转移至一个250 ml锥形管中，用添加了HA的M199洗涤液定容至250 ml，并准备取样。
- 用移液器取1 ml样品加入预先装有9 ml洗涤液的15 ml锥形管中。然后轻轻倒置15 ml锥形管混匀，从中直接取1 ml加入网格计数皿中。计数细胞，并使用2500（10×250）的稀释因子计算细胞数量。
- 将250 ml锥形管离心后，加入150 ml通常用于器官保存的UW（威斯康星大学）溶液。加入UW溶液后，用移液器充分混匀细胞悬液。记录并向纯化工序操作人员通报在UW溶液中的起始时间。将管子置于冰上并偶尔轻轻摇晃。此时可进一步纯化胰岛。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
影响胰岛分离结果的因素多种多样9,10。其中，胰腺组织的消化过程起着关键作用。根据我们自身的人胰岛分离经验，总结了以下可能影响胰岛产量和质量的关键因素。
- 使用不同类型的酶时，消化时间有所不同。
- 一旦40-50%的胰岛完全从腺泡组织中分离，应立即加入稀释液并冷却组织，以终止消化过程。
- 在收集、洗涤和混匀组织时，操作应轻柔。
- 收集的组织与UW溶液的混合物应置于冰上至少30分钟，以获得更好的纯化效果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
由伊利诺伊大学芝加哥分校、胰岛细胞资源中心 NIH 基金（RFA-RR 05-003）、克里斯托弗基金会、埃夫罗姆森基金会和特拉布斯基金会资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 冰沙机 | 设备 | Taylor Company | K4036546 | 制备无菌冰 |
| 离心机 | 设备 | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 倒置显微镜 TLBD4.1 | 设备 | Leica Microsystems | 4103 | |
| 带2 mm网格的细胞培养皿 | 设备 | Nalge Nunc international | 174926 | 胰岛计数 |
| EX7 数字水浴锅 | 设备 | NesLab | 105361058 | |
| 温度计 | 设备 | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc 天平 AB 104-S | 设备 | Mettler Toledo | 1119430864 | 测量胰腺重量 |
| MasterFlex II 转速控制器 | 设备 | Cole-Parmer | J00006445 | 调节消化过程中的流速 |
| Digital Sight DS L1 | 设备 | Nikon Instruments | 217267 | |
| 灌注装置 | 设备 | 定制 | n/a | |
| 灌注装置冷却器 | 设备 | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi 室 | 设备 | 迈阿密大学 | n/a | |
| RPMI 稀释液 | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| 威斯康星大学（UW）溶液 | 试剂 | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s 缓冲盐溶液（HBSS） | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% 人血白蛋白 | 试剂 | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 培养基（洗涤液） | 试剂 | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| 胶原酶 NB1 GMP 级 | 试剂 | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| 中性蛋白酶 NB1 GMP 级 | 试剂 | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| 聚维酮碘 | 试剂 | Cardinal Health | 29906-004 | |
| 头孢唑林 | 试剂 | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| 二苯硫腙 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D5130 |
参考文献
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
