监测植物在胁迫响应过程中的激素变化

摘要

提供了一种简单的方法，可从小份植物组织样品中快速提取并分析多种植物激素。该方法以气相萃取作为唯一的纯化步骤，样品通过化学电离的气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行分析，化学电离主要产生 (M+1)+ 离子。

摘要

植物激素及相关信号分子在调控植物对各种环境刺激和胁迫的响应中发挥着重要作用。其中最严重的胁迫包括昆虫取食、病原菌侵染以及干旱胁迫。针对每一种胁迫，已知特定的一组激素或其组合可精细调节植物的响应，从而确保其存活。参与调控这些响应的主要激素包括茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）。为了更深入理解单个激素在这些响应中的作用及其潜在的相互作用，有必要在时间和空间维度上监测这些激素丰度的变化。为实现对这些及其他信号分子进行简便、灵敏且可重复的定量分析，我们建立了一种基于气相萃取与气相色谱/质谱联用（GC/MS）分析的方法（1, 2, 3, 4）。该方法首先使用酸性水-正丙醇与二氯甲烷混合液从植物组织中提取目标化合物，随后将含羧基的化合物甲基化，在加热条件下使其挥发并富集于聚合物吸附剂上。待洗脱至样品瓶后，分析物通过气相色谱分离，并采用化学电离质谱法进行检测。通过使用适当内标物，可依据分析物与内标物的峰面积比值实现简便定量。

方案

1. 首先我们需要准备用于提取的 2 ml 螺口小瓶：向小瓶中加入 400 µl 提取缓冲液（1-丙醇:H₂O:浓盐酸，体积比为 2:1:0.002）和 10 µl 相应的内标物（10 ng/µl）。将小瓶置于液氮中冷冻，然后加入陶瓷珠。
2. 在小瓶仍处于液氮中时，加入植物材料（50 至 200 mg）。请注意，在进一步处理前必须估算所加入植物材料的重量，以便后续基于鲜重进行准确定量。
3. 在用瓶盖紧密封闭小瓶前，确保所有液氮均已挥发。请注意，瓶盖必须带有橡胶密封圈，以防止在均质过程中溶剂泄漏，从而避免提取物的损失。
4. 在 FastPrep 或 Precellys 珠磨式均质器中以 6000 速度（Precellys）均质组织 30 秒。
5. 从均质器中逐一取出小瓶，小心打开瓶盖，向每个样品中加入 1 ml 二氯甲烷。再次紧密盖上瓶盖，并在 6000 速度（Precellys）下再次均质 10–15 秒。
6. 将小瓶转移至台式离心机中，在 10,000×g 条件下离心 60 秒，以分离有机相和水相。
7. 相分离后，将下层绿色层（有机相，含有激素和内标物）从小瓶转移至洁净的 4 ml 玻璃小瓶中。避免转移上层水相。或者，也可使用乙酸乙酯替代二氯甲烷；在此情况下，乙酸乙酯相为上层（绿色），更易于移取，应转移至新的 4 ml 玻璃小瓶中。同样需避免转移水相。
8. 通过多通道吹气装置用空气吹干溶剂，约需 10–25 分钟（取决于样品）；使用单个气流针头检查样品是否完全干燥（需小心操作）。切勿过度干燥样品，以免造成化合物损失。
9. 样品干燥后，即可开始对样品中含羧基的化合物进行甲基化。首先向每个小瓶中加入 100 µl 二乙醚/甲醇混合液（9:1，体积比），随后加入 4 µl 2 M 三甲基硅基重氮甲烷溶液（正己烷溶液，Sigma Aldrich）。立即用带有聚四氟乙烯衬垫硅胶隔垫的敞口螺帽封闭小瓶。轻轻振荡，并在室温下孵育 25 至 30 分钟。
10. 完成第 9 步后，开启加热块并设定所需的收集温度。甲基化化合物的挥发性取决于其分子大小，也受其他极性基团（如 =O、-OH 和 -NH）的影响。对于茉莉酸和水杨酸甲酯，收集温度约 80°C 即可；而其他化合物如 C18 脂肪酸、茉莉酸-氨基酸结合物、冠菌素以及 12-氧-植物二烯酸甲酯，则需要 180–200°C 的温度才能有效挥发。
11. 甲基化反应孵育 30 分钟后，需终止反应以避免发生非预期的副反应。向每个小瓶中加入 4 µl 2 M 乙酸溶液（正己烷溶液），盖紧瓶盖并短暂涡旋混匀，随后让样品再孵育 30 分钟。
12. 本实验所用的气相萃取过滤器为手工制作，目前市场上无此商品化产品。过滤器由一段外层聚四氟乙烯管（长约 7–8 cm）构成，从一端插入一段长约 4 cm 的紧密匹配的玻璃管。在聚四氟乙烯管的另一端，将一片不锈钢网片推入管内，直至其接触内部玻璃管，然后在网片上加入约 20–30 mg 吸附剂（SuperQ 80/100（已停产）或 HayeSep® Q80/100）。再插入另一片不锈钢网片，最后将玻璃尖端推入聚四氟乙烯管中，小心压紧不锈钢网片上的吸附剂。图 1 显示了过滤器的详细结构。
    
    图 1.
13. 在第 11 步孵育期间，需对用于收集甲基化后挥发性植物激素的过滤器进行清洗：先用 200 µl 甲醇清洗，再用 200 µl 二氯甲烷清洗两次。用空气吹干滤芯中残留的溶剂。此后，过滤器即可用于通过气相萃取捕获挥发性激素。
14. 孵育 30 分钟后，用手术刀片将 4 ml 小瓶盖上的橡胶隔垫切开。将清洗后的过滤器连接至独立的真空管线（流速约 800 ml/min），用于通过气相萃取收集植物激素。将过滤器通过切开的隔垫插入小瓶中，同时插入一根小移液枪头作为进气口。在该步骤初始阶段，必须将装有过滤器的小瓶保持直立，以防止瓶内液体接触滤芯，否则会污染过滤器并进而污染 GC/MS 系统。用手持小瓶直至瓶内液体全部通过过滤器蒸发。随后将连接过滤器的小瓶置于加热块上，继续加热并收集挥发性化合物 3 分钟。该系统的原理及装置如图 1 所示。完成最终的气相萃取步骤后，将连接过滤器的小瓶置于支架上冷却。
15. 当过滤器再次降至室温后，用 150 µl 二氯甲烷将其中的化合物洗脱至配有内插管的 1.5 ml GC 小瓶中。吹干滤芯中残留溶剂后，盖上瓶盖，进行 GC/MS 分析。

应使用配备分流/不分流进样口（不分流模式，250°C，进样体积1μL）并与在化学电离模式（CI）下运行的质谱仪联用的气相色谱仪进行分析。化合物在HP-1MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上分离，进样后柱温保持在40°C 1分钟，随后以15°C/min的升温速率程序升温至250°C（保持10分钟），载气为氦气（恒定流速0.7 mL/min）。对于基于质谱的分析，可使用四极杆质谱仪（例如Agilent HP5973）或离子阱质谱仪（例如Varian Saturn 2200）。CI反应气可选用异丁烷（储存在气体钢瓶中）或甲醇（使用液体储液产生的蒸气），但在每种情况下，均应在建立选择离子计数（SIC）程序前确认电离反应产生的碎片离子。我们针对Varian GC 3900/Saturn MS 2200系统并以甲醇作为CI试剂，采用如下程序：5.00–11.30分钟，监测离子(M+1)⁺ 153–158（水杨酸甲酯153，²H₅-水杨酸甲酯158）；11.30–13.30分钟，监测离子(M+1)⁺ 207–228（茉莉酸甲酯207和225，二氢茉莉酸甲酯209和227）；13.30–16.30分钟，监测离子(M+1)⁺ 237–300（脱落酸甲酯261，²H₆-脱落酸甲酯267（脱落酸主要产生[M-H₂O+1]⁺离子））。所有化合物均需通过与市售的真实标准品比对进行鉴定。茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）的定量是通过将目标峰面积（提取离子）与相应内标物的峰面积（提取离子）进行比较完成的，并基于所用植物材料的鲜重进行计算。

讨论

本文所述方法已被证实可稳定适用于多种植物信号化合物，前提是化合物的分子大小和化学性质不会阻碍其提取、甲基化和汽化。此外，本文所描述的甲基化步骤并非唯一的衍生化方法。硅烷化和乙酰化是其他可选方法，相关方案可轻松在线获取。

如果质谱仪不具备单离子监测功能，则在运行过程中记录的质荷比范围应加以限制，以避免过多无关离子进入分析过程。例如，茉莉酸（JA）及其内标二氢茉莉酸（dhJA）在甲醇化学电离条件下会产生两个主要的（M+1）⁺离子，JA对应207和225，dhJA对应209和227。由于JA和dhJA的这两个主要（M+1）⁺质荷比离子（JA为207和225；dhJA为209和227）的丰度比并不一致，因此应同时提取这两个离子用于定量分析。因此，应记录207至228的质荷比范围，随后再提取特定离子进行分析。