监测植物在胁迫响应过程中的激素变化

摘要

提供了一种简单的方法，可从小份植物组织样品中快速提取并分析多种植物激素。该方法以气相萃取作为唯一的纯化步骤，样品通过化学电离的气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行分析，化学电离主要产生 (M+1)+ 离子。

摘要

植物激素及相关信号分子在调控植物对各种环境刺激和胁迫的响应中发挥着重要作用。其中最严重的胁迫包括昆虫取食、病原菌侵染以及干旱胁迫。针对每一种胁迫，已知特定的一组激素或其组合可精细调节植物的响应，从而确保其存活。参与调控这些响应的主要激素包括茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）。为了更深入理解单个激素在这些响应中的作用及其潜在的相互作用，有必要在时间和空间维度上监测这些激素丰度的变化。为实现对这些及其他信号分子进行简便、灵敏且可重复的定量分析，我们建立了一种基于气相萃取与气相色谱/质谱联用（GC/MS）分析的方法（1, 2, 3, 4）。该方法首先使用酸性水-正丙醇与二氯甲烷混合液从植物组织中提取目标化合物，随后将含羧基的化合物甲基化，在加热条件下使其挥发并富集于聚合物吸附剂上。待洗脱至样品瓶后，分析物通过气相色谱分离，并采用化学电离质谱法进行检测。通过使用适当内标物，可依据分析物与内标物的峰面积比值实现简便定量。

方案

1. 首先我们需要准备用于提取的 2 ml 螺口小瓶：向小瓶中加入 400 µl 提取缓冲液（1-丙醇:H₂O:浓盐酸，体积比为 2:1:0.002）和 10 µl 相应的内标物（10 ng/µl）。将小瓶置于液氮中冷冻，然后加入陶瓷珠。
2. 在小瓶仍处于液氮中时，加入植物材料（50 至 200 mg）。请注意，在进一步处理前必须估算所加入植物材料的重量，以便后续基于鲜重进行准确定量。
3. 在用瓶盖紧密封闭小瓶前，确保所有液氮均已挥发。请注意，瓶盖必须带有橡胶密封圈，以防止在均质过程中溶剂泄漏，从而避免提取物的损失。
4. 在 FastPrep 或 Precellys 珠磨式均质器中以 6000 速度（Precellys）均质组织 30 秒。
5. 从均质器中逐一取出小瓶，小心打开瓶盖，向每个样品中加入 1 ml 二氯甲烷。再次紧密盖上瓶盖，并在 6000 速度（Precellys）下再次均质 10–15 秒。
6. 将小瓶转移至台式离心机中，在 10,000×g 条件下离心 60 秒，以分离有机相和水相。
7. 相分离后，将下层绿色层（有机相，含有激素和内标物）从小瓶转移至洁净的 4 ml 玻璃小瓶中。避免转移上层水相。或者，也可使用乙酸乙酯替代二氯甲烷；在此情况下，乙酸乙酯相为上层（绿色），更易于移取，应转移至新的 4 ml 玻璃小瓶中。同样需避免转移水相。
8. 通过多通道吹气装置用空气吹干溶剂，约需 10–25 分钟（取决于样品）；使用单个气流针头检查样品是否完全干燥（需....

讨论

本文所述方法已被证实可稳定适用于多种植物信号化合物，前提是化合物的分子大小和化学性质不会阻碍其提取、甲基化和汽化。此外，本文所描述的甲基化步骤并非唯一的衍生化方法。硅烷化和乙酰化是其他可选方法，相关方案可轻松在线获取。

如果质谱仪不具备单离子监测功能，则在运行过程中记录的质荷比范围应加以限制，以避免过多无关离子进入分析过程。例如，茉莉酸（JA）及其内标二氢茉莉酸（dhJA）在甲醇化学电离条件下会产生两个主要的（M+1）⁺离子，JA对应207和225，dhJA对应209和227。由于JA和dhJA的这两个主要（M+1）⁺质荷比离子（JA为207和225；dhJA为209和227）的丰度比并不一致，因此应同时提取这两个离子用于定量分析。因此，应记录207至228的质荷比范围，随后再提取特定离子进行分析。

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