方法文章

Channelrhodopsin2介导的突触电位刺激果蝇神经肌肉接头

DOI：

10.3791/1133

⸱

2009年3月16日

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此过程使用蓝色光激活藻通道和细胞特异性基因表达的工具，以唤起光脉冲在神经肌肉接头（NMJ）突触潜力果蝇幼虫。这种技术是一种廉价和易于使用替代吸电极刺激突触生理学研究，在研究和教学实验室。

方案

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第1部分:动物保健和遗传杂交

  1. 保持无人机，ChR2和8个单独的瓶含有标准的飞行媒体OK371 GAL4飞线。
  2. 收集OK371 - GAL4飞线和UAS - ChR2线的男性处女。
  3. 将男性和女性在包含标飞1毫米全反式视网膜（ATR）的混合介质的小瓶。 ATR食品应首先融化在定期飞〜1分钟微波介质。一旦融化，使冷却约30秒到一分钟，然后加入100μL100％乙醇10毫升每飞行媒体的ATR 100毫米。瓶置于冰上，然后将其存储在暗区，在4 ° C。
  4. 让果蝇交配打下鸡蛋中的暗区，在22-25 ° C。
  5. 等待3-4天，直到3龄幼虫可见，在这一点上，处理成蝇。

第2部分:钻机安装

  1. 附加任何10X解剖范围眼睛一块蓝色LED（在我们的例子中，卡尔蔡司公司，www.zeiss.com，Thornwood，纽约），带散热片的光源（托尔实验室，www.thorlabs.com，牛顿，新泽西州）。附加磁性底座后，钳。电气接地屏蔽，以减少由光源所产生的电气噪声覆盖散热片。
  2. 对空气电钻机表光源放置磁性底座。
  3. 光源连接到控制电路和控制电路连接到外部电压源（4 / 30 PowerLab系统，ADInstruments，www.adinstruments.com，科罗拉多州的斯普林斯，一氧化碳）。
  4. 给1-5 V脉冲控制电路，以激活蓝灯。
  5. 调整磁性底座和光源，直到蓝色光柱集中幼虫清扫占用的面积。

第3部分:夹层

  1. 放置六个0.1毫米到地板的一个sylgard内衬的菜虫引脚。
  2. 删除任何塑料的Petri盘3 路从食物中媒体和地方的幼虫。
  3. 用生理盐水冲洗，清除食物的幼虫。
  4. 幼虫在解剖盘附近的拉引脚和补充生理盐水半水平。
  5. 东方的幼虫，所以，你可以看到两个银色管（气管），沿动物的背水面上运行。
  6. 尾巴大针直接插入气管导管之间的。保持幼虫和其头部放入第二个大针，一定要纵向舒展身体。
  7. 设为尾巴附近的一个小切口，并继续它的身体的长度。确保剪刀的技巧提高，使不意外削减腹侧神经和/或体壁肌肉。
  8. 动物的四个角上放置四个引脚现在开放的腹部。他们解剖盘设置成圆角动物。引脚编制出教。
  9. 使用镊子和剪刀，消除动物的内脏，气管和脂肪组织。
  10. 用生理盐水冲洗准备。
  11. 找到额叶（图A）和腹侧神经节的预习。
  12. 采用微型剪刀，小心地穿过仅次于额叶腹侧神经节。

第4部分:肌肉录音和蓝色光刺激

  1. 拉10-20μω电极使用电子电极拉马（萨特仪器）。
  2. 填写带3米氯化钾拉电极。
  3. 广场充满了附近幼虫准备在解剖显微镜上电钻机下的显微电极，在电极支架和机动电极尖端。
  4. 确定在任何体壁段的肌肉（图A）6（M6）。
  5. 小心地放入M6的电极，并观看快速极化。肌肉静息膜电位，应该是任何地方从-30毫伏到-70毫伏。
  6. 调整蓝色的光芒，使解剖准备在光束中心。
  7. 给予20-100毫秒脉冲电压控制电路。逐步增加提供给控制电路的电压。注意在肌肉细胞的兴奋交界的潜力（图1B）。

代表性的成果:

图1A显示了录音的设置和剔骨准备的示意图。图1B显示了典型的EJP短的光脉冲诱发。 EJP幅度显示总结既支配M6从两个电机神经元的幅度。光照强度下，只激活一个运动单位（数据未显示）。

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图1:A）细胞内记录钻机和蓝色LED的一般原理图。拆下来抑制大脑（BR）是在腹侧神经节（VG）的有节奏的活动。 ChR2表示使用GAL4 - UAS的系统在电机神经元。二）从M6的肌肉细胞内记录。 40毫秒蓝色光脉冲（127μW/毫米2）可靠地唤起M6突触潜力大（星号） 。

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讨论

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关键步骤涉及的初步解剖和进入肌肉细胞。如果神经被切断，或在初始剥离肌肉受损，就很难继续实验的休息。在清扫过程中，必须非常谨慎的角度在背的切口，向上为尽可能解剖剪刀。在第二个关​​键的一步，进入肌肉细胞，一个必须注意的一个极化过去〜30 mV的。 -30毫伏以上的值指示电极是不是肌肉细胞内或在一个不健康的细胞正常。

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披露

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我们有没有利益冲突披露。

致谢

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这项工作得到了国家卫生赠款RO1GM - 33205和MH - 067284研究院立法会格里菲斯和一个布兰代斯大学的夏季本科生科研奖学金，新泽西州Hornstein。作为2008年神经系统和行为暑期课程（镍氢补助金:R25 MH059472）的一部分，马在伍兹霍尔海洋生物实验室进行这项技术的初步实验。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SylgardEllsworth 胶粘剂4019862www.ellsworth.com
Minutens Pins精美科学工具26002-10www.finescience.com
解剖盘Fisher Scientificwww.fishersci.com
神经探针细胞内放大器和头部A-M 系统680100www.a-msystems.com
>Powerlab 4/30 数据采集系统figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
草刺激器Grass Technologieswww.grasstechnologies.com
台式电脑Dellwww.dell.com
剖析范围徕卡显微系统www.leica-microsystems.com
光源Dolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
全反式视网膜Sigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 苍蝇布卢明顿股票中心
UAS-ChR2飞行Fiala 实验室、格里菲斯实验室
LED 控制器电路内置格里菲斯实验室http://www.ledsupply.com
http://www.futureelectronics.com
由以下部分组成：
1。200 mA 降压盘
2.蓝色 LED
3.绝缘线
4.电路面包板
LED 散热器Thorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
空气表TMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
法拉第笼内置于格里菲斯实验室
徕卡Leitz M 微型机械手徕卡显微系统ACS01www.leica-microsystems.com
电极支架Axon Instrumentswww.axon.com
硼硅酸盐玻璃FHC， Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
电极拉拔器Sutter Instrument Co.www.sutter.com
HL 含0.8mM Ca2+含量（mM）的3.1盐水：
NaCl：70 KCl：5 CaCl2： 0.8
MgCl2：4蔗糖：115
NaHCO3： 10 海藻糖：5 HEPES
显微解剖工具精细科学工具www.finescience.com

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

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Drosophila Neuromuscular JunctionGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

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