该实验利用蓝光激活的藻类通道蛋白和细胞特异性基因表达工具，在果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处通过光脉冲诱导突触电位。该技术为科研和教学实验室中的突触生理学研究提供了一种成本低廉且易于使用的替代方法，可取代传统的吸吮电极刺激。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
TheDrosophila幼虫神经肌肉制备已被证明是研究突触生理学的有用工具1,2,3目前，对此制备标本诱发兴奋性接头电位（EJPs）的唯一可用方法是使用吸吮电极。在科研和教学实验室中，学生常常难以操作和操控这类刺激电极。在本研究中，我们展示了如何在不使用吸吮电极的情况下，远距离刺激幼虫神经肌肉接头（NMJ）的突触电位。通过表达光敏通道蛋白2（ChR2）4,5,6在Drosophila使用运动神经元GAL4-UASsystem7，并对基础的电生理设备进行微小改造后，我们能够通过蓝光脉冲可靠地诱发出终板电位（EJPs）。该技术可能特别适用于神经生理学教学实验室，在此类实验室中，学生的设备操作时间和资源往往有限。
方案
第一部分：动物护理与遗传杂交
- 维持 UAS-ChR2 和 OK371-GAL4 将果蝇品系分别饲养于含有标准果蝇培养基的独立培养瓶中 8.
- 收集处女蝇 OK371-GAL4 果蝇品系及UAS-ChR2品系的雄性个体。
- 将雄性和雌性果蝇放入含有标准果蝇培养基并添加1 mM 全反式视黄醛（ATR）的试剂管中。ATR食物的制备方法如下：首先将常规果蝇培养基放入微波炉中加热约1分钟，直至完全融化；待其冷却约30秒至1分钟后，加入ATR 100 μl 每10 ml果蝇培养基中加入100 mM ATR的100% ETOH溶液。将试管置于冰上，随后储存在黑暗处 4°C.
- 让果蝇在22-25°C的黑暗环境中交配并产卵25°C.
- 等待3-4天，直至观察到3龄幼虫；此时，处理掉成虫果蝇。
第二部分：设备设置
- 将任意10倍解剖镜目镜（本实验中使用卡尔蔡司公司，Carl Zeiss Inc.，www.zeiss.com，纽约州索恩伍德）连接至带散热片的蓝色LED光源（Thorlabs，www.thorlabs.com，新泽西州纽顿）。将其固定于带支柱和夹具的磁性底座上。用接地的金属屏蔽罩覆盖散热片，以减少光源产生的电噪声。
- 将带有光源的磁性底座放置在电生理装置的隔振台上。
- 将光源连接至控制电路，并将控制电路连接至外部电压源（Powerlab 4/30，ADInstruments，www.adinstruments.com，科罗拉多州科罗拉多斯普林斯）。
- 向控制电路施加1–5 V的脉冲以激活蓝光。
- 调节磁性底座和光源位置，直至蓝光光束聚焦于幼虫解剖操作区域。
第3部分：解剖
- 将六根0.1 mm的昆虫针插入硅胶衬里的培养皿底部。
- 从培养基中取出一只3rd 龄幼虫，并放入任意塑料培养皿中。
- 用生理盐水冲洗幼虫以去除食物残留。
- 将幼虫置于解剖皿中靠近拉制好的针附近，并加入生理盐水至皿高的1/2处。
- 调整幼虫方向，使其背侧表面可见两条银色管状结构（气管）沿身体纵轴延伸。
- 将一根大头针直接插入尾部两根气管之间的位置，固定住幼虫，再将第二根大头针插入其头部，确保将身体沿纵轴拉直。
- 在尾部附近做一小切口，并沿身体长度方向继续剪开。剪切时确保剪刀尖端略微上抬，以免意外剪断腹侧神经和/或体壁肌肉。
- 将四根针分别固定在动物打开后的中段四个角上，插入解剖皿中，以实现动物的剖开固定。确保组织被充分拉紧。
- 使用镊子和剪刀，小心移除动物的内脏、气管和脂肪体。
- 用生理盐水冲洗标本。
- 在标本上定位前脑叶（如图A所示）以及腹神经节。
- 使用显微剪刀，在前脑叶后方小心地剪断腹神经节。
第4部分：肌肉记录与蓝光刺激
- 使用电子电极拉制仪（Sutter Instruments）拉制一个 10–20 μΩ 的电极。
- 用 3 M KCl 溶液填充已拉制的电极。
- 将填充好的电极放入电极夹持器中，并在电生理装置的解剖显微镜下，使用显微操作器将电极尖端移至幼虫标本附近。
- 在任一躯体节段中识别第6号肌肉（M6）（图A）。
- 小心地将电极插入M6肌肉中，并观察是否出现快速的超极化现象。肌肉的静息膜电位通常在 -30 mV 至 -70 mV 之间。
- 调节蓝光位置，使解剖后的标本位于光束中心。
- 向控制电路施加 20–100 ms 的电压脉冲，并逐步增加供给控制电路的电压。观察肌细胞中是否出现兴奋性接头电位（图1B）。
代表性结果：
图1A展示了记录装置和去肌膜制备的示意图。图1B显示了短光脉冲诱发的典型兴奋性接头电位（EJP）。所示EJP幅度为已知均支配M6的两个运动神经元的总和幅度。较低的光强度仅激活一个运动单位（数据未显示）。
图1：A) 带有蓝色LED的细胞内记录装置通用示意图。移除脑（Br）以抑制腹神经节（VG）中的节律性活动。使用GAL4-UAS系统在运动神经元中表达ChR2。B) 来自M6肌肉的细胞内记录。40毫秒的蓝色光脉冲（光强为127 µW / mm2）可在M6中可靠地诱发大幅突触电位（星号标注）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
关键步骤包括最初的解剖操作以及进入肌细胞的过程。如果在初始解剖过程中神经被切断或肌肉受到损伤，则很难继续完成后续实验。在解剖过程中，进行背侧切口时必须尽可能将解剖剪向上倾斜，操作时需格外小心。在第二个关键步骤——进入肌细胞时，应观察是否出现超过约30 mV的超极化现象。若电位值高于-30 mV，则表明电极可能未正确进入肌细胞，或细胞处于不健康状态。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目RO1GM-33205和MH-067284（授予L.C. Griffith）以及布兰迪斯大学本科生暑期科研奖学金（授予N. J. Hornstein）的支持。该技术的初步实验是在马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室（Marine Biological Laboratory）进行的，作为2008年神经系统与行为暑期课程（NIMH资助项目：R25 MH059472）的一部分。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| 显微操作针 | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| 解剖皿 | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe 细胞内放大器及探头 | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 数据采集系统 |  ADInstruments | www.adinstruments.com | |
| Grass 刺激器 | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| 台式计算机 | Dell | www.dell.com | |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| 光源 | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| 果蝇培养基 | |||
| 全反式视黄醛 | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 果蝇 | Bloomington Stock Center | ||
| UAS-ChR2 果蝇 | Fiala 实验室，Griffith 实验室 | ||
| LED 控制电路 | Griffith 实验室自制 | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com 组成包括： 1. 200 mA 降压恒流驱动器（Buck Puck） 2. 蓝色 LED 3. 绝缘导线 4. 电路面包板 | |
| LED 散热片 | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| 气浮隔振台 | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| 法拉第笼 | Griffith 实验室自制 | ||
| Leica Leitz M 微操作器 | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| 电极夹持器 | Axon Instruments | www.axon.com | |
| 硼硅酸盐玻璃管 | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| 电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| 含 0.8 mM Ca²⁺ 的 HL 3.1 生理盐水 | 成分（mM）： NaCl:70 KCl:5 CaCl₂: 0.8 MgCl₂:4 蔗糖:115 NaHCO₃: 10 海藻糖: 5 HEPES | ||
| 显微解剖工具 | Fine Science Tools | www.finescience.com |
参考文献
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
