肌源性工程组织构建物的制备

摘要

在此，我们演示了包含骨骼肌成肌细胞的胶原基组织工程构建物的制备方法。这些三维工程化构建物可用于组织的替代或修复 体内为实现这一目的，我们设计了房室电传导通路，用于完全性心脏传导阻滞的修复^[1].

摘要

尽管电子起搏器是挽救生命的重要医疗设备，但由于儿童体型较小且身体必然持续生长，该设备在儿科患者中的长期性能可能存在问题。因此，迫切需要开发专为患有心律失常的儿科患者设计的创新疗法。我们提出，一种由胶原蛋白基质负载自体来源细胞构成的导电性生物替代物，可能更适应生长需求，减少反复手术的需要，并显著提高这些患者的生活质量。在本研究中，我们描述了一种将原代骨骼肌成肌细胞培养物整合入水凝胶基质中的方法，以构建一种可外科植入的组织结构，该结构将作为心脏心房与心室之间的电传导通路。最终，我们期望利用此类工程化组织恢复完全性心脏传导阻滞患儿的心房-心室电传导。为此，我们采用改良的经典实验方案，从新生Lewis大鼠的骨骼肌中分离成肌细胞，并将其接种于层粘连蛋白包被的组织培养皿中。^{[2, 3]}. 一到两天后，收集培养的细胞，并与抗生素、I型胶原、Matrigel™ 和 NaHCO₃ 混合。₃结果是一种粘稠且均匀的溶液，可浇铸成几乎任意形状和尺寸的模具^{[1, 4, 5]}. 对于我们的组织构建物，我们采用标准方法从胎羊皮肤中分离的Ⅰ型胶原蛋白^[6]. 一旦组织在 37°C 下固化，需小心向培养板中加入培养基，直至完全浸没构建物。随后，通过脱水使工程化组织进一步收缩，持续 2 天，此时组织即可用于后续实验。in vitro评估或外科植入。

方案

第1部分：组装构建体浇铸模具

1. 使用剃刀将硅胶管（VWR）沿中线切开，并切成3 cm长的小段。
2. 在每段管子两端内侧各滴一滴植入级室温硫化硅胶粘合剂（Rhodia）。
3. 迅速将一小块（1 cm × 1 cm）聚酯网片（McMaster-Carr）放置在硅胶粘合剂液滴上，并与管端对齐，以提供略微凸起且平整的构建物附着表面。另一端重复此操作。
4. 将模具在室温下干燥3天。建议一次性制备20至30个模具，因为这些模具基本为一次性使用。
5. 待粘合剂完全干燥后，将这些模具储存于盛有70%乙醇的烧杯中，直至使用。此步骤有助于对模具进行灭菌，成品如图1所示。

第二部分：成肌细胞分离的准备工作

1. 将1 mg层粘连蛋白（Laminin，Sigma）溶于250 mL经0.22 μm滤膜过滤除菌的磷酸盐缓冲液（PBS）中，其中含1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin，Invitrogen）和1%两性霉素B（Fungizone，Invitrogen）。
2. 用4 mL步骤1.1中稀释的层粘连蛋白溶液包被150 mm组织培养皿（BD Falcon），在接种原代骨骼肌成肌细胞前于37ºC孵育至少4小时。
3. 通过将Ham’s F-10营养混合物（Sigma）与20%胎牛血清（FBS，Atlanta Biologicals）、5 ng/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Promega）、1%青霉素/链霉素（Invitrogen）和1%两性霉素B（Fungizone，Invitrogen）混合，制备成肌细胞培养基。
4. 通过将1 g约295 U/mg的胶原酶2（Collagenase 2，Worthington）溶解于100 mL 2.4 U/mL Dispase-2（Roche）中，制备骨骼肌消化液。加入0.037 g CaCl₂并充分混匀。使用安装在10 mL注射器上的0.2 µm滤膜过滤除菌消化缓冲液，并将分装样品储存于-20°C。将用于组织消化所需量的溶液与成肌细胞培养基一同置于37°C预热。

第3部分：从骨骼肌中分离成肌细胞

1. 使用镊子和小剪刀，沿脊髓纵向切开新生死亡Lewis大鼠背部，剥离皮肤和筋膜层，然后切除脊旁肌。
2. 在组织培养超净台中，将切除的肌肉置于装有40 mL 1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Invitrogen）的50 mL圆锥形离心管（BD Falcon）中，并置于冰上。让肌肉条自然沉降至管底，在超净台（Baker）中用无菌巴斯德吸管通过真空抽吸小心去除大部分液体和血液残留物。
3. 将收获的肌肉组织块倒入150 mm培养皿中，用抽吸法尽可能去除残留液体。使用两把单刃剃须刀片将组织切碎成浓稠糊状。将预热的消化液倒在糊状物上，用10 mL移液管将混合物转移至新的50 mL离心管中。在酶消化过程中，间歇性地用连接无绳移液助吸器（Pipette-Aid，Drummond）的10 mL移液管轻轻吹打（避免产生气泡）。再次让组织沉降，并去除多余液体。
4. 将离心管置于摇床上，于37°C孵育约30分钟进行消化。
5. 当肌肉完全液化后，将溶液通过70 μm细胞滤筛（BD Falcon）过滤，并在室温下以600 × g离心10分钟（Beckman GP）。用巴斯德吸管和抽吸装置尽可能去除上清液，然后用10 mL温热的成肌细胞培养基重悬沉淀。
6. 将细胞预接种于未包被的150 mm组织培养皿中，静置15分钟，以帮助去除成纤维细胞。
7. 将未贴壁的细胞转移至经层粘连蛋白（laminin）包被的培养器皿中，并稀释至每1至2只新生大鼠对应一个培养皿。将培养皿置于设定为37°C、含5% CO₂的加湿培养箱中培养。

第4部分：制备工程化组织构建物（5 mL）

1. 培养1至2天后，从培养箱中取出10个150 mm的成肌细胞组织培养皿，用37°C的1×PBS冲洗两次，每皿加入4 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，再放回培养箱中孵育5分钟。
2. 在生物安全操作台中收集从培养皿上脱落的成肌细胞，将液体收集至50 mL离心管（BD Falcon）中。用10 mL成肌细胞培养基冲洗所有培养皿，并将冲洗液合并至离心管中。在室温下以600 × g离心10分钟（Beckman GP），按步骤3.5所述去除上清液。
3. 将成肌细胞重悬于1.6 mL成肌细胞培养基中，并置于冰上。
4. 使用镊子小心地从步骤1.5中取出4个构建模具，用1×PBS冲洗两次。用巴斯德吸管通过真空抽吸彻底去除残留的PBS，然后将每个模具放入6孔组织培养板（BD Falcon）中。
5. 将构建制备所需的其他试剂（10×Ham’s F10、抗生素、I型胶原蛋白[3.9 mg/mL]^[6]和Matrigel™）置于冰上，同时将成肌细胞培养基保持在37°C。在15 mL锥形管中加入500 μL 10×Ham’s F10、100 µL青霉素/链霉素、100 µL两性霉素B（Fungizone）、1.6 mL胶原蛋白和750 µL Matrigel™。使用Mini-Vortexer（VWR，设定为10）混合10秒，然后置于冰上。
6. 接着，向步骤3.5所得混合液中加入80 µL NaHCO₃以及步骤3.3中的成肌细胞悬液。将整个混合物涡旋振荡10秒，然后将试管放回冰桶中静置数分钟，以去除溶液中的气泡。
7. 在混合物开始凝固前，使用10 mL移液管小心地将其浇注至模具中。每个模具可容纳约1 mL黏稠液体。操作过程中应尽量避免引入气泡。
8. 小心将含有浇注后构建物的培养板转移至培养箱中。约30分钟后，从培养箱中取出已固化的构建物，小心地向每孔中加入成肌细胞培养基，以完全覆盖组织构建物。然后将培养板放回培养箱中（图2）。

第5部分：代表性结果

当本方案正确执行后，含有成肌细胞的组织构建物即可用于 体内 植入（即从模具中取出后）或进一步 体外 2天后进行分析。

图1. 已完成的构建模具示例（见步骤1.5）。

图2. 含有成肌细胞的已固化组织构建物^[1]。

图3. 含有成肌细胞的组织构建物的H&E染色切片。“A”为纵切面，“B”为横切面。

讨论

用于浇铸组织构建物的模具可制成任意形状和尺寸，但必须至少具备两个固定点。否则，基质和细胞会形成球形结构，导致细胞死亡。在本方案中，我们描述了使用聚酯网作为固定材料的方法，但我们也已成功使用不锈钢网。显然，较大的模具需要更多的细胞以及更大体积的其他组分。在制作模具时，应尽量减少硅胶粘合剂的用量，并确保其仅位于导管的最末端。这是因为靠近粘合剂的成肌细胞即使在固化数天后也往往无法存活。此外，在制备组织构建物前，成肌细胞的接种培养时间应仅限于一至两天，因为污染的成纤维细胞会迅速增殖，最终压倒培养物中的成肌成分。同样，成肌细胞不应密度过高接种，因为相互接触的细胞会开始融合并分化为肌管。关于组织构建物的制备，目前市面上有多种可获取的I型胶原来源，但不同产品的凝固速度和最终产物的一致性存在差异。此外，胶原制剂绝不能经紫外线照射，因为该过程会抑制胶凝作用。据我们观察，构建物在固化过程中颜色会从深粉色变为浅粉色。最后，我们所用的胶原为酸溶性（非胃蛋白酶消化）制备，因此在加入细胞之前，需通过添加 NaHCO₃ 来提高步骤 3.5 中混合物的 pH 值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶管	VWR international	60985-724
硅胶粘合剂	Rhodia Silicones	MED ADH 4300 RTV
聚酯网筛	McMaster-Carr	93185T17
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
HAM F-10 营养混合物	Sigma-Aldrich	N6908
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140
抗真菌剂（Fungizone）	Invitrogen	15290-018
Dispase-2	Roche Group	10295825001
胶原酶 2	Worthington Biochemical	46H8863
碱性成纤维细胞生长因子	Promega Corp.	G5071
150 mm 细胞培养皿	BD Biosciences	353025
0.05% (1X) 胰蛋白酶-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
1X 亨克平衡盐溶液	Invitrogen	14170-112
7.5% NaHCO3	GIBCO, by Life Technologies	25080-094
70 μm 细胞滤器	BD Biosciences	352350
6 孔板	BD Biosciences	353046
50 mL 圆锥形离心管	BD Biosciences	352098
15 mL 圆锥形离心管	BD Biosciences	352099
0.2 μm 滤膜	Nalge Nunc international	194-2520