在此，我们演示了包含骨骼肌成肌细胞的胶原基组织工程构建物的制备方法。这些三维工程化构建物可用于组织的替代或修复 体内为实现这一目的，我们设计了房室电传导通路，用于完全性心脏传导阻滞的修复[1].
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摘要
摘要
尽管电子起搏器是挽救生命的重要医疗设备，但由于儿童体型较小且身体必然持续生长，该设备在儿科患者中的长期性能可能存在问题。因此，迫切需要开发专为患有心律失常的儿科患者设计的创新疗法。我们提出，一种由胶原蛋白基质负载自体来源细胞构成的导电性生物替代物，可能更适应生长需求，减少反复手术的需要，并显著提高这些患者的生活质量。在本研究中，我们描述了一种将原代骨骼肌成肌细胞培养物整合入水凝胶基质中的方法，以构建一种可外科植入的组织结构，该结构将作为心脏心房与心室之间的电传导通路。最终，我们期望利用此类工程化组织恢复完全性心脏传导阻滞患儿的心房-心室电传导。为此，我们采用改良的经典实验方案，从新生Lewis大鼠的骨骼肌中分离成肌细胞，并将其接种于层粘连蛋白包被的组织培养皿中。[2, 3]. 一到两天后，收集培养的细胞，并与抗生素、I型胶原、Matrigel™ 和 NaHCO₃ 混合。3结果是一种粘稠且均匀的溶液，可浇铸成几乎任意形状和尺寸的模具[1, 4, 5]. 对于我们的组织构建物，我们采用标准方法从胎羊皮肤中分离的Ⅰ型胶原蛋白[6]. 一旦组织在 37°C 下固化，需小心向培养板中加入培养基，直至完全浸没构建物。随后，通过脱水使工程化组织进一步收缩，持续 2 天，此时组织即可用于后续实验。in vitro评估或外科植入。
方案
第1部分：组装构建体浇铸模具
- 使用剃刀将硅胶管（VWR）沿中线切开，并切成3 cm长的小段。
- 在每段管子两端内侧各滴一滴植入级室温硫化硅胶粘合剂（Rhodia）。
- 迅速将一小块（1 cm × 1 cm）聚酯网片（McMaster-Carr）放置在硅胶粘合剂液滴上，并与管端对齐，以提供略微凸起且平整的构建物附着表面。另一端重复此操作。
- 将模具在室温下干燥3天。建议一次性制备20至30个模具，因为这些模具基本为一次性使用。
- 待粘合剂完全干燥后，将这些模具储存于盛有70%乙醇的烧杯中，直至使用。此步骤有助于对模具进行灭菌，成品如图1所示。
第二部分：成肌细胞分离的准备工作
- 将1 mg层粘连蛋白（Laminin，Sigma）溶于250 mL经0.22 μm滤膜过滤除菌的磷酸盐缓冲液（PBS）中，其中含1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin，Invitrogen）和1%两性霉素B（Fungizone，Invitrogen）。
- 用4 mL步骤1.1中稀释的层粘连蛋白溶液包被150 mm组织培养皿（BD Falcon），在接种原代骨骼肌成肌细胞前于37ºC孵育至少4小时。
- 通过将Ham’s F-10营养混合物（Sigma）与20%胎牛血清（FBS，Atlanta Biological....
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讨论
用于浇铸组织构建物的模具可制成任意形状和尺寸，但必须至少具备两个固定点。否则，基质和细胞会形成球形结构，导致细胞死亡。在本方案中，我们描述了使用聚酯网作为固定材料的方法，但我们也已成功使用不锈钢网。显然，较大的模具需要更多的细胞以及更大体积的其他组分。在制作模具时，应尽量减少硅胶粘合剂的用量，并确保其仅位于导管的最末端。这是因为靠近粘合剂的成肌细胞即使在固化数天后也往往无法存活。此外，在制备组织构建物前，成肌细胞的接种培养时间应仅限于一至两天，因为污染的成纤维细胞会迅速增殖，最终压倒培养物中的成肌成分。同样，成肌细胞不应密度过高接种，因为相互接触的细胞会开始融合并分化为肌管。关于组织构建物的制备，目前市面上有多种可获取的I型胶原来源，但不同产品的凝固速度和最终产物的一致性存在差异。此外，胶原制剂绝不能经紫外线照射，因为该过程会抑制胶凝作用。据我们观察，构建物在固化过程中颜色会从深粉色变为浅粉色。最后，我们所用的胶原为酸溶性（非胃蛋白酶消化）制备，因此在加入细胞之前，需通过添加 NaHCO3 来提高步骤 3.5 中混合物的 pH 值。
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披露
动物实验严格按照波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院研究基金（HL068915；HL088206）、Thrasher研究基金会新研究员奖以及波士顿儿童医院心脏传导基金捐款的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅胶管 | VWR international | 60985-724 | |
| 硅胶粘合剂 | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| 聚酯网筛 | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| HAM F-10 营养混合物 | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| 抗真菌剂（Fungizone） | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| 胶原酶 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm 细胞培养皿 | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X 亨克平衡盐溶液 | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm 细胞滤器 | BD Biosciences | 352350 | |
| 6 孔板 | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm 滤膜 | Nalge Nunc international | 194-2520 |
参考文献
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125
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