为了研究禾谷镰刀菌子囊孢子的发育过程，本实验拍摄了在无菌条件下收集子囊孢子的操作流程，以期为实验方案的描述提供尽可能详尽的信息。这将有助于提高实验的可重复性，尤其是在进行全基因组表达谱检测时，这一点至关重要。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schwabe，有性型为Gibberella zeae）是一种植物病原真菌，可引起小麦和大麦的赤霉病，导致作物产量和籽粒品质下降。禾谷镰刀菌还可引起玉米的茎腐病和穗腐病，并产生如单端孢霉烯类等真菌毒素，污染谷物，对人类和家畜有害（Goswami 和 Kistler，2004）。
该真菌产生两种类型的孢子。子囊孢子是其有性生殖产生的繁殖体，为主要的初侵染源。这些孢子从成熟的子囊壳中被强力释放，并通过风力传播（Francl 等，1999）。再侵染主要由大型分生孢子引起，后者通过无性方式在植物表面产生。为了研究该真菌子囊孢子的发育过程，需要一种在无菌条件下大量收集子囊孢子的操作流程。本实验方案已拍摄成视频，以提供最大程度的信息，便于理解与重复；尤其在进行全基因组基因表达谱的生成与解读时，这一点至关重要。特别是，子囊孢子的萌发率和生物学活性会受到前期材料处理方式的影响。因此，建议采用视频记录子囊孢子制备的每一步骤，以提高实验标准化程度，满足微阵列分析日益严格的要求。该操作仅需常规实验室设备，步骤设计可防止污染并促进子囊孢子在时间上的同步化。
方案
- 在直径为 9 cm 的培养皿中制备胡萝卜琼脂（Klittich 和 Leslie，1988）。
- 将含有在马铃薯葡萄糖琼脂上新鲜生长的菌丝体的 2 mm 琼脂块置于每个培养皿的中央。
- 培养物在 25°C 及 12 小时光照/12 小时黑暗光周期条件下培养 96 小时。
- 向培养物表面加入 1 ml 2.5% 的吐温 60 水溶液（Trail 和 Common，2000），并用塑料棒轻轻按压，使溶液均匀覆盖培养物表面。
- 在 25°C 及相同光周期条件下，将处理后的培养物置于高湿度环境中，7–10 天后子囊壳开始弹射子囊孢子。
- 通过更换培养皿盖进行孢子收集，将子囊壳在黑暗条件下弹射一定时间（例如 12 小时）。
- 向皿盖中加入无菌水，轻轻晃动使子囊孢子悬浮于水中。
- 将子囊孢子收集至无菌 Falcon 管中，洗涤后用于后续分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方案基于先前用于尖孢镰刀菌（Fusarium spp.）子囊壳产生的实验方法（Klittich 和 Leslie，1988；Trail 和 Common，2000）。为了确保实验的可重复性，必须对产生大量子囊孢子（足以用于微阵列分析）的操作流程进行标准化。已有报道指出，环境因素、菌龄以及培养基差异均可能改变子囊孢子的生物学特性（Beyer 和 Verreet，2005）。因此，视频记录能够突出展示孢子产生与收集过程中的细微操作要点，有助于提高实验的可重复性。特别是该操作视频可提升不同实验室之间的标准化水平，并促进需要子囊孢子产生的全基因组转录研究之间的比较。由于实验所需RNA量相对较大，因此需同步处理大量培养皿。当需要在新型生物材料上开展全基因组转录研究时，视频是一种尤为适用的工具，可为后续实验建立统一标准。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
作者感谢Karen Hilburn提供的出色技术支持。本项目由美国农业部合作州立研究、教育与推广服务局的国家研究倡议（资助号：2004-35604-14327）资助。Matias Pasquali获得Branco Weiss奖学金的支持。同时感谢美国小麦和大麦赤霉病倡议项目对本研究的持续支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 9 厘米直径培养皿 | 工具 | |||
| Tween 60 (20%) | 试剂 | |||
| 胡萝卜琼脂（20% w/v 有机胡萝卜和 1.5% w/v 琼脂） | 试剂 |
参考文献
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
