我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。
本文内容
摘要
摘要
我们的项目在发育中的幼虫果蝇神经肌肉突触处鉴定出表达GFP标记的胶质结构。为了观察活体胶质-神经-肌肉突触的发育过程，我们建立了一种幼虫组织制备方法，该方法既保留了活体完整幼虫的特性，又具备良好的光学性质。这种新的制备方法还允许灌流液进入突触区域。我们使用果蝇幼虫，将其浸入人工血淋巴液中，并通过低温处理抑制其正常的节律性身体收缩。随后，解剖去除每只幼虫的后部体节，并用钝头昆虫针将口器部分向后推入体腔，使幼虫体壁外翻，类似于将袜子内面翻出。接着使用超细解剖剪完成解剖，从而暴露体壁肌肉的内脏面。位于神经肌肉接头（NMJ）处的胶质结构在胶质细胞特异性启动子的调控下表达膜定位的GFP。肌肉中突触后膜结构——亚突触网（SSR，Subsynaptic Reticula）则表达突触靶向的dsRed。我们需要对突触的第三组成部分——运动神经元末梢进行急性标记。为此，我们使用与远红外荧光染料偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗进行标记。为了检测荧光染料分子向运动神经元末梢与SSR之间突触周围间隙的扩散特性，我们施加了与远红外荧光染料偶联的大分子右旋糖酐溶液，并采集图像。
方案
第1部分：组织制备
- 我们的目标是制备一种果蝇幼虫组织，其中神经系统保持完整，同时体壁肌肉的内表面暴露于人工血淋巴中，并可紧贴显微镜盖玻片以获得良好的光学效果。换句话说，即一种内外翻转的幼虫制备样本。
由于传统的组织制备方法通常涉及切割、固定和拉伸体壁肌肉，有时还需移除部分神经系统，因此我们需要采用一种不同的方法。
我们希望将动物内外翻转，以便能够清晰观察突触中随时间变化的结构特征和结构动态，同时保持神经系统的完整性。我们还希望避免拉伸组织以及激活牵张感受器，否则会引起肌肉抽搐，从而破坏成像质量。 - 首先，对实验动物进行分期。取摄食期三龄幼虫或游走期三龄幼虫，因其体型较大、易于解剖，本实验将以W3期幼虫为例进行演示。该幼虫具有Tubby表型，体型宽大，易于外翻。
仅使用观察到正在活跃爬行的幼虫，包括W3期幼虫。 - 在含有双蒸水的培养皿中，用极柔软的画笔清洁蛆体表面。清洁后的幼虫具有更好的光学特性，且可减少细菌污染。
- 将幼虫转移至盛有约3 ml冰冻HL-6人工血淋巴的小培养皿中，并将培养皿置于冰上，直至幼虫停止活动并完全松弛（约5分钟）。
- 一手持精细尖头镊子，另一手持弹簧剪刀。我习惯用惯用手操作剪刀。用剪刀在体壁上刺一个小孔，以平衡体壁内外的压力。
- 用镊子轻轻将幼虫固定在培养皿底部，剪除后端两个体节。解剖过程中，内脏和脂肪体会从体腔中移出，需一并剪除。
- 用精细镊子将幼虫固定在培养皿底部，手持一支#0昆虫针（钝头），顶住幼虫口器部位，将口器推入体腔，如同将袜子内面翻出一般，完成外翻操作。
- 内外翻转后的组织应如图所示。使用超细解剖工具，小心去除体壁上的脂肪体和气管。务必极其小心，避免牵拉气管或断开神经系统。撕裂气管会导致体壁肌肉出现破孔。
尽可能清除所有脂肪体。这两种结构均会干扰组织的光学质量。建议在进行此操作前避免饮用咖啡。 - 完成操作后，肌肉应呈半透明状，而非不透明或白色。若将组织制备样本置于不含谷氨酸的HL-6溶液中，并在室温下孵育，其可能因中枢神经系统中的运动模式发生器仍在工作而出现节律性收缩。
应避免使用体壁肌肉明显收缩或不规则收缩的制备样本。
完整且内外翻转的体壁组织容易沿背侧和腹侧中线对折，因此制备样本通常呈现为左侧或右侧的“半体动物”结构，便于观察。 - 1.9 可将组织样本置于小型商用腔室（如Warner腔室）中，或采用桥式盖玻片结构的载玻片进行封片。有关组织封片的建议，请参见第3部分。
第二部分：使用荧光标记的抗 HRP 一抗对神经元突触小泡进行标记。
- 在培养皿中滴加50微升针对HRP的荧光标记一抗（溶于HL-6缓冲液），将翻转的体壁制备物浸入染料溶液中。约5分钟后可观察到神经末梢的标记，但为获得完整且明亮的标记，建议孵育10–20分钟。
- 在室温下用HL-6缓冲液漂洗10–30秒，以去除未结合的染料。未结合的染料可迅速被洗脱，因此漂洗过程无需剧烈。
- 根据需要调整染料浓度和孵育时间。
第3部分：使用葡聚糖荧光素偶联物标记突触周围间隙
- 将荧光标记的葡聚糖染料用HL-6稀释。适用于我们实验目的的浓度为：
- 如果您不关注染料进入细胞外空间的时间，可在“桥接”盖玻片（见第4部分）上滴加20微升染料，并将样品浸入染料液滴中。
第4部分：组织封片以进行观察（使用共聚焦显微镜）。
如果无需对样本进行灌流（短时间观察）或希望减少浴液HL-6的用量，可采用双桥式载玻片法
如果需要对样本进行灌流，可尝试使用灌流室。我们使用的是 Warner Instruments 公司的改良型灌流室。
以下详细介绍两者细节。
将样品固定在双桥载玻片上。
- 使用非常洁净的显微镜载玻片。将两片18 mm的方形盖玻片（#1.5）用超级胶水粘附在载玻片上，两片盖玻片边缘之间保留2 mm的间隙。
- 让胶水完全干燥，否则会在样本周围的水性介质上形成异常薄膜。
- 将翻转的幼虫置于盖玻片边缘之间。如果幼虫较大，且成像系统像素阵列有限，可能需要将样本以对角线方向放置。
- 用一片#1.5、18 mm的洁净盖玻片覆盖组织。使用极少量凡士林将“顶部”盖玻片粘附在载玻片上已固定的两侧盖玻片上。
- 在顶部盖玻片上滴加一滴Cargill定制的折射率为1.3379的物镜油（若使用HL-6），然后将整个装置翻转过来。
- 将组织装置放置在显微镜上，使油面朝向物镜，并调节物镜焦距。
使用改良灌流室固定组织。 - 将一片#1.5盖玻片粘在RC-20灌流室中作为底部。按照RC-20说明书将组织放入灌流室中，并使用Nytex网片代替盖玻片作为灌流室的顶部。
第5部分：代表性结果：
- 组织外翻制备的解剖步骤：
W3期幼虫，经清洗后（“Tubby”表型）（5.1.1）。W3期幼虫，后部两个体节已解剖。可见脂肪体因体壁压力被推出体腔（箭头所示）。为尽量减少内脏“外溢”，可在解剖前1分钟于体壁上制造一个小孔（5.1.2）。在将组织外翻之前已完成内脏去除的制备样本（5.1.3）。组织大部分已外翻，固定针位于组织腔内（箭头所示）（5.1.4）。此时肌肉位于外侧，表皮位于内侧，部分脂肪体和气管仍附着其上（5.1.5）。完全解剖后的组织制备样本，几乎所有的脂肪体和气管均已去除（5.1.6）。
- 利用抗-HRP抗体对幼虫神经肌肉接头进行活体标记。图示为一个典型的W3期幼虫神经-肌肉突触，包含胶质细胞延伸结构（外翻制备）。运动神经元轴突终末使用针对HRP的一抗（品红色）标记，并与Cy5偶联。胶质细胞突起以GFP（绿色）标记。
- 在外翻制备样本中，使用Alexa 680标记的葡聚糖荧光显示突触周围间隙。胶质细胞突起（绿色）由膜定位GFP标记。肌肉表面的突触后次级褶皱结构（SSR）以dsRed标记（蓝色）。Alexa葡聚糖（红色）在细胞外区域聚集，在突触周围间隙形成环状（类似“甜甜圈”形状）的染料池。葡聚糖染料标记与dsRed标记的SSR以灰度图显示。注意多个环状染料池清晰勾勒出突触周围间隙（箭头所示）。
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讨论
该方法可实现对活体标记蛋白和细胞过程的长期成像。in situ 组织制备样品具有完整且功能正常的中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及反射回路。与标准的幼虫果蝇肌肉实验方案相比，该组织制备方法具有优势；在标准方案中，幼虫体壁肌肉被拉伸（当其被固定展开时），而拉伸可能导致突触形态扭曲，并引发基于反射的肌肉收缩。我们的外翻式制备样品机械稳定性良好，光学性能极佳，有利于对细胞动态变化进行高分辨率的实时分析。此外，外翻式制备样品可存活长达一小时，能够实现对突触变化的长时间观察。
解剖过程中，注意避免损伤外周神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）。同时避免撕扯或牵拉气管，以免损伤肌细胞。尽量使体壁肌肉保持松弛状态。将HL-6溶液及组织冷却可使体壁肌肉松弛，并降低贯穿体壁的张力。人工血淋巴中含有钙离子（2 mM），对胶质细胞的健康和形态至关重要。
成像必须在稳定且不发生收缩的肌肉组织上进行。虽然5 mM谷氨酸能有效阻断神经诱发的肌肉收缩，但钙通道阻滞剂硝苯地平可能是一种有用的替代方案。10微摩尔浓度的硝苯...
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致谢
本项目由加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。我们感谢Barb Jusiak在构建表达dsRed标记的SSR（BJ品系）果蝇品系方面所做的贡献，以及不列颠哥伦比亚大学生物成像中心提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| HL-6：人工果蝇血淋巴，添加5 mM L-谷氨酸和2 mM 钙 | 试剂 | N/A | NA | 5 mM L-谷氨酸可阻断肌肉收缩。我们使用了分子级L-谷氨酸（Sigma）。2 mM 钙浓度接近天然幼虫血淋巴中的生理钙水平。参考文献：Macleod 等，2002 年；Macleod，2004 年 |
| 葡聚糖，Alexa Fluor 680；分子量10,000，阴离子型，可固定 | 试剂 | Molecular Probes, Life Technologies | D34680 | 使用小体积灌流室以保持染料总体积较低 |
| 抗-HRP-CY5偶联物（山羊来源） | 试剂 | Jackson ImmunoResearch | 123-175-021 | 将2.0 mg溶解于1 ml ddH₂O中；分装为每份4微升。在–20°C下冷冻保存。每次实验取一份分装样品，溶于100微升HL-6中使用 |
| Alexa 647抗体标记试剂盒 | 试剂 | Molecular Probes, Life Technologies | A10475 | 我们共制备了80微升偶联的一抗溶液，并分装为每份2微升保存。每次标记时将一份分装样品稀释至100微升HL-6中使用 |
| 定制配方物镜油，折射率1.3379 | 试剂 | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| 超细镊子 | 工具 | Fine Science Tools | 11252-23 或 11295-20 | |
| 弹簧剪刀 | 工具 | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| 超细修枝剪刀 | 工具 | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 灌流室RC 20系列 | 工具 | Warner Instruments | 64-02222 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | 显微镜 | Quorum Technologies | Quorum Wave FX | 安装在Leica DMI6000倒置显微镜上 |
参考文献
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
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