解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

摘要

将电生理学技术应用于可及的突触，可对突触活动进行量化测量，有助于分析突触突变体。本文描述了一种用于暴露秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans (C. elegans)）神经肌肉接头（NMJ）的解剖方法，并简要讨论了该制备样品的一些应用方向。

摘要

神经传递是指神经元在快速的时间尺度上通过化学信号将信息传递给其突触后靶标的生理过程。这一复杂过程需要许多突触前和突触后蛋白的协同作用，以确保突触连接的适当性、电信号的传导、分泌囊泡的靶向与启动、钙离子感应、囊泡融合、突触后受体的定位与功能，以及最终的回收机制。作为神经科学家，我们的目标是阐明在这些步骤中发挥功能的各类蛋白质，并理解其作用机制。对突触进行电生理记录可定量反映突触传递过程中发生的底层电事件。通过将该技术与可用于操控秀丽隐杆线虫（C. elegans）中突触蛋白的强大分子与遗传工具相结合，我们能够分析突触传递中由此产生的功能变化。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动神经元与体壁肌之间的神经肌肉接头（NMJs）控制其运动行为，因此，表现出运动不协调表型（称为 unc）的突变体通常会干扰这些突触处的突触传递¹。由于 unc 突变体可在丰富的细菌食物来源上维持培养，只要它们保留一定的咽部泵吸能力以摄取食物，便可存活。这一特性，加上 C. elegans 以雌雄同体形式存在的特点，使其能够在无需复杂交配行为的情况下将突变后代遗传下去。这些优势，结合我们近期能够在活体线虫的神经肌肉接头上进行电生理记录的技术进步^2,3,7，使该生物成为精确研究 unc 突变体如何影响神经递质传递的优良模式生物。

解剖方法涉及使用氰基丙烯酸酯胶水固定成虫，以便在蠕虫角质层上做切口，暴露神经肌肉接头（NMJ）。由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）成虫体长仅为1 mm，解剖需借助解剖显微镜进行，并要求极佳的手眼协调能力。通过全细胞电压钳技术记录单个体壁肌细胞，可获得NMJ信号；神经递质释放可通过多种刺激方案诱发，包括电刺激、光激活通道视紫红质介导的去极化⁴以及高渗盐水刺激，这些方法均将简要描述。

方案

A. 解剖所用工具的准备。

1. 解剖/记录室：我们通常使用1/16英寸^th 1英寸磁性板，中心钻有一个圆形孔，孔径足够容纳直径为22 mm的圆形盖玻片。腔室的外部尺寸取决于用于记录的显微镜载物台。在磁性板的背面，我们粘附一块48 × 60 mm的盖玻片，通过在盖玻片与腔室之间的四个角各放置一粒低熔点Paraplax组织包埋蜡颗粒，将盖玻片固定于腔室上。随后将装置置于加热板上加热，玻璃面朝上，直至蜡完全熔化并形成连续层，将盖玻片牢固粘合至腔室。此步骤不可离开，因蜡熔化迅速。一旦蜡完全熔化，应立即将腔室取下并冷却。渗入22 mm圆形凹腔内边缘的多余蜡可用刀片边缘清除。
2. Sylgard 涂层盖玻片：解剖操作在记录室圆形腔室内的 22 mm Sylgard 涂层盖玻片上进行。Sylgard 涂层有助于在用氰基丙烯酸酯胶水固定线虫时增强其与盖玻片的粘附性，同时在胶水堵塞移液管尖端时可作为缓冲垫用于折断堵塞的移液管尖。Sylgard 按照生产商说明书新鲜配制（按重量计，10 份硅胶基础剂与 1 份固化剂混合）。将少量 Sylgard 滴加至每片盖玻片上，用刀片边缘涂抹均匀，形成平整表面。涂覆后的盖玻片置于大型扁平带盖容器中，并放置于 65° 在烘箱中于指定温度下过夜固化。
3. 移液管：通常，我们使用相同规格的外径为1 mm的细丝硼硅酸盐玻璃管，通过电极拉制仪制备用于固定线虫、切割角质层以及肌肉记录的移液管。建议在开始解剖前预先拉制一罐移液管，因为此步骤可能需要频繁更....

讨论

遗传模式生物 C. elegans 非常适合通过分析编码突触蛋白的基因突变来研究突触传递。本文介绍了一种解剖技术，使 C. elegans 的神经肌肉接头（NMJs）可用于电生理分析。配套视频展示了 C. elegans 解剖过程中的关键步骤以及用于记录突触活动的典型记录配置。学习该技术最具挑战性的三个步骤是：1）固定线虫步骤，2）成功完成切口，3）在体壁肌细胞上形成膜片钳。一旦掌握这些步骤，即可在电压钳或电流钳模式下记录突触后肌细胞的反应。利用这种解剖制备方法，可在多种突变背景下便捷地测量诱发刺激的反应。鉴于野生型成年线虫本身体积已非常微小（体长约为 1 mm），那些无法发育至成虫阶段或体型瘦小的突触突变体可能不适用于此解剖方法。腹神经索中的运动神经元也非常微小（胞体直径为 2–5 μm），对电生理记录人员提出了额外挑战，尽管已有多个实验室成功地在此类解剖制备的基础上，对 C. elegans 神经元进行了电生理记录^{5 6}。

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