解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

摘要

将电生理学技术应用于可及的突触，可对突触活动进行量化测量，有助于分析突触突变体。本文描述了一种用于暴露秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans (C. elegans)）神经肌肉接头（NMJ）的解剖方法，并简要讨论了该制备样品的一些应用方向。

摘要

神经传递是指神经元在快速的时间尺度上通过化学信号将信息传递给其突触后靶标的生理过程。这一复杂过程需要许多突触前和突触后蛋白的协同作用，以确保突触连接的适当性、电信号的传导、分泌囊泡的靶向与启动、钙离子感应、囊泡融合、突触后受体的定位与功能，以及最终的回收机制。作为神经科学家，我们的目标是阐明在这些步骤中发挥功能的各类蛋白质，并理解其作用机制。对突触进行电生理记录可定量反映突触传递过程中发生的底层电事件。通过将该技术与可用于操控秀丽隐杆线虫（C. elegans）中突触蛋白的强大分子与遗传工具相结合，我们能够分析突触传递中由此产生的功能变化。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动神经元与体壁肌之间的神经肌肉接头（NMJs）控制其运动行为，因此，表现出运动不协调表型（称为 unc）的突变体通常会干扰这些突触处的突触传递¹。由于 unc 突变体可在丰富的细菌食物来源上维持培养，只要它们保留一定的咽部泵吸能力以摄取食物，便可存活。这一特性，加上 C. elegans 以雌雄同体形式存在的特点，使其能够在无需复杂交配行为的情况下将突变后代遗传下去。这些优势，结合我们近期能够在活体线虫的神经肌肉接头上进行电生理记录的技术进步^2,3,7，使该生物成为精确研究 unc 突变体如何影响神经递质传递的优良模式生物。

解剖方法涉及使用氰基丙烯酸酯胶水固定成虫，以便在蠕虫角质层上做切口，暴露神经肌肉接头（NMJ）。由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）成虫体长仅为1 mm，解剖需借助解剖显微镜进行，并要求极佳的手眼协调能力。通过全细胞电压钳技术记录单个体壁肌细胞，可获得NMJ信号；神经递质释放可通过多种刺激方案诱发，包括电刺激、光激活通道视紫红质介导的去极化⁴以及高渗盐水刺激，这些方法均将简要描述。

方案

A. 解剖所用工具的准备。

1. 解剖/记录室：我们通常使用1/16英寸^th 1英寸磁性板，中心钻有一个圆形孔，孔径足够容纳直径为22 mm的圆形盖玻片。腔室的外部尺寸取决于用于记录的显微镜载物台。在磁性板的背面，我们粘附一块48 × 60 mm的盖玻片，通过在盖玻片与腔室之间的四个角各放置一粒低熔点Paraplax组织包埋蜡颗粒，将盖玻片固定于腔室上。随后将装置置于加热板上加热，玻璃面朝上，直至蜡完全熔化并形成连续层，将盖玻片牢固粘合至腔室。此步骤不可离开，因蜡熔化迅速。一旦蜡完全熔化，应立即将腔室取下并冷却。渗入22 mm圆形凹腔内边缘的多余蜡可用刀片边缘清除。
2. Sylgard 涂层盖玻片：解剖操作在记录室圆形腔室内的 22 mm Sylgard 涂层盖玻片上进行。Sylgard 涂层有助于在用氰基丙烯酸酯胶水固定线虫时增强其与盖玻片的粘附性，同时在胶水堵塞移液管尖端时可作为缓冲垫用于折断堵塞的移液管尖。Sylgard 按照生产商说明书新鲜配制（按重量计，10 份硅胶基础剂与 1 份固化剂混合）。将少量 Sylgard 滴加至每片盖玻片上，用刀片边缘涂抹均匀，形成平整表面。涂覆后的盖玻片置于大型扁平带盖容器中，并放置于 65° 在烘箱中于指定温度下过夜固化。
3. 移液管：通常，我们使用相同规格的外径为1 mm的细丝硼硅酸盐玻璃管，通过电极拉制仪制备用于固定线虫、切割角质层以及肌肉记录的移液管。建议在开始解剖前预先拉制一罐移液管，因为此步骤可能需要频繁更换移液管。
4. 胶水涂抹器：通过口部施加压力，从胶水移液管的尖端加载并涂抹胶水。将胶水移液管插入一段长约2英尺、内径与移液管玻璃外径相匹配（通常为1 mm）的聚乙烯管的一端。聚乙烯管的另一端连接一个Eppendorf移液器吸头，用作吹气口嘴。
5. 提取毛细管：在切开线虫体壁后，必须将虫体内的内脏组织从体腔中移除。这一操作可通过连接在Eppendorf移液器吸头上的 tubing 实现，其结构类似于胶水施加器，但此处所用的玻璃提取毛细管尖端需适当折断，使其口径足够大，以便于通过负压将虫体内的卵和内脏组织轻松吸出。

B. 解剖步骤

1. 在记录室中，靠近腔室边缘处用圆形蜡笔画出一圈蜡线，将涂有Sylgard的盖玻片牢固地压在蜡线上（Sylgard涂层朝上）。该蜡线可固定盖玻片，并防止记录液在解剖和记录过程中渗入盖玻片下方导致其移位。随后向腔室中加入细胞外记录液，并用挑虫针将数条线虫置于腔室中央。线虫会在溶液中游动，但经过练习后，无需采取降温等额外措施抑制其运动，即可直接将其胶粘固定。在训练阶段，可先练习粘附运动能力受损的突变型线虫（例如 unc-31 突变体），以提高操作熟练度。
2. 使用由PCR管盖制成的胶水容器（插入蜡或油泥中固定）盛装氰基丙烯酸酯胶的现用储备液。采用与记录电极相似尖端尺寸的胶水移液管（通常电阻约为 ~4 兆欧）来施加胶水。使用胶水施加器，在解剖显微镜下观察移液管尖端的同时，将少量胶水吸入胶水移液管中。
3. 氰基丙烯酸酯胶（HistoacrylBlue, Aesulap）在接触细胞外记录液时会迅速聚合，因此胶水移液管进入腔室液体时必须保持正压，以防止胶水提前固化并堵塞移液管。一旦胶水移液管进入腔室液中，需立即通过口控施加持续而微小的胶流至Sylgard表面，以防堵塞。若移液管发生堵塞，可尝试轻轻敲击其尖端于Sylgard涂层玻璃表面以疏通。建议在正式粘附线虫前先练习胶水操作。若能常规性地在Sylgard表面用胶水写出自己的姓名，且笔画细于线虫宽度，则表明已具备粘附线虫角质层的能力。
4. 粘附线虫时，利用正压将少量胶水附着于线虫头部或尾部，并迅速将线虫拉向Sylgard表面使其贴附。应尽量将线虫固定在腔室中心区域，因过于靠近边缘的线虫将难以被记录电极触及。随后从初始附着点开始，沿虫体背侧边缘持续施加胶流，使线虫呈C形弯曲，阴门朝内（适用于腹侧肌肉记录）。需补全胶线中的任何空隙，确保线虫牢固附着，以防在角质层切开步骤中脱落。
5. 进行角质层切开时，更换为手持式解剖移液管。该移液管需比胶水/记录移液管更尖锐，且具有短而坚固的杆部。在解剖显微镜最高倍率下，将移液管与线虫纵轴平行对齐，并从线虫中段（靠近阴门处）插入尖端，在角质层与胶线交界处实施切开。此切口可释放线虫体内静水压，促使卵和肠道组织从切口处挤出。继续以类似拆信封的切片动作沿角质层向头部方向切割，直至到达咽部。随后换用提取移液管吸除线虫内部器官。清除内容物后，打开的角质层将保持圆柱状形态。使用新的胶水移液管对角质层切缘进行点焊式固定，将其压在Sylgard表面。此阶段应尽量减少胶点使用，避免损伤或遮挡神经肌肉接头（NMJs）。
   此时，腹神经索和体壁肌肉已暴露。
6. 为去除覆盖神经肌肉接头的基底膜，先吸除腔室中的细胞外记录液，加入胶原酶（0.4 mg/mL，溶于细胞外记录液）处理约10–20秒；随后吸除胶原酶并用新鲜细胞外记录液多次冲洗。完成清洗后，进入记录阶段。

C. 膜片钳记录

1. 使用10倍物镜将记录室置于直立显微镜载物台上，以居中定位线虫。切换至40倍水浸物镜并配合微分干涉差（DIC）观察，检查体壁肌肉和腹神经索是否完整。调整线虫位置，使其纵轴与显微镜前缘平行，以便电极可从左右两侧同时引入。
2. 采用标准膜片钳技术对肌肉进行记录。电阻约为4兆欧的记录电极效果良好。当电极接触肌肉膜后，逐渐增加负压，直至形成吉欧姆（gigohm）级密封。在全细胞电压钳记录模式下，进一步施加吸力并施加电击，使吉欧姆密封破裂。在良好的记录中，野生型成年线虫的体壁肌肉通常具有约70 pF的细胞膜电容，并可在-60 mV的钳制电位下稳定记录至少10分钟，同时保持极小的钳制电流（约50 pA）。
3. 细胞外记录液成分如下（单位为 mM）：NaCl 150，KCl 5，CaCl₂ 5，MgCl₂ 4，葡萄糖 10，蔗糖 5，HEPES 15（pH 7.3，约 330 mOsm）。膜片电极内液成分如下（单位为 mM）：KCl 120，KOH 20，MgCl₂ 4，(N-三羟甲基甲基-2-氨基乙烷磺酸) TES 5，二水合 CaCl₂ 0.25，Na₂ATP 4，蔗糖 36，EGTA 5（pH 7.2，约 312 mOsm）。注意：这些溶液人为地使肌肉细胞内氯离子浓度升高，因此在-60 mV钳制电位下，GABA受体介导的电流表现为内向电流（由氯离子外流引起）。已有对上述溶液的多种改良方案（详见相关文献）。
4. 诱发释放。通常我们将第二个含有细胞外溶液的电极放置于已钳制肌肉前方的腹神经索上。这种松散贴附（loose patch）构型需要施加高强度短时程（1–2 ms）的去极化刺激（电压达数十伏），才能在野生型线虫中获得最大诱发反应（通常为2.0–2.5 nA）。该方法的局限性包括：1）在神经索发生不可逆损伤前仅能施加少数几次刺激；2）由于未知原因，该刺激构型仅能诱发胆碱能反应。
5. 光激活通道视紫红质刺激。近期，Gottschalk 实验室已构建出转基因线虫，其特定神经元中表达来源于藻类的通道视紫红质，在光照下可引起膜去极化，具体表达神经元取决于所使用的启动子⁴。针对C. elegans神经肌肉接头（NMJ），目前已获得在胆碱能运动神经元或GABA能运动神经元中表达通道视紫红质的稳定整合品系。由于通道视紫红质仅在全反式视黄醛与视蛋白结合后才对光产生响应，因此用于该实验的线虫必须在添加视黄醛的细菌培养基中生长。通过绿色光脉冲可重复激活通道视紫红质，从而诱发乙酰胆碱（ACh）或GABA的释放，具体取决于所使用的转基因品系。这些转基因品系可与突变品系进行杂交。该技术相较于前述电刺激的优势在于：1）光激活不会造成神经元损伤，允许多次重复刺激；2）可独立研究来自GABA能或胆碱能运动神经元的诱发释放。
6. 高渗诱导释放。为测量可立即释放囊泡池的大小（反映所有作用于记录肌肉的NMJ上已启动囊泡的总和），使用含有高渗细胞外液（通过添加额外蔗糖调节至约850 mOsm）的压力电极。施加1–3秒的压力脉冲，可利用上述标准溶液引发一系列异步的突触后事件。

图1：秀丽隐杆线虫（C. elegans）解剖及神经肌肉记录配置的示意图

将一滴Sylgard涂抹在盖玻片上并过夜固化，制成Sylgard包被的盖玻片，随后将其放入预制记录室的圆形腔室中，并用记录液覆盖。将一条线虫置于中央，从头部或尾部开始，使用胶水移液器将线虫背侧粘附于Sylgard表面。胶合完成后，用玻璃针在阴门附近、角质层与胶水交界处做一 incision（见红色虚线），并向头部方向延伸。从体腔中取出内脏和卵后，用胶水将切口边缘局部“点焊”固定于Sylgard表面，从而暴露腹侧神经（绿色）和体壁肌肉（红色）。对阴门前侧的腹侧中线肌肉进行膜片钳记录，刺激电极则放置于神经索上游位置。

代表性结果

本图展示了上述三种刺激方案（电刺激诱发、光刺激诱发和高渗刺激反应）下体壁肌肉的全细胞电压钳记录。所有情况下，腹侧中线体壁肌肉均钳制在 -60 mV。A. 在我们的标准记录溶液中，野生型肌肉细胞通常表现出较高频率的自发性内向微小突触电流。B. 对腹侧神经索前段施加持续2毫秒的去极化刺激，可引起多个突触同步释放神经递质，从而在野生型线虫中诱发约2–2.5 nA的大电流反应。A和B图右侧的代表性曲线显示了严重运动失调突变体（unc-18）中的突触释放情况。C图展示了在胆碱能神经元中表达通道视紫红质的野生型线虫神经肌肉接头处的光诱发反应。通常，持续2毫秒的光脉冲可产生1.5–1.8 nA的反应电流。D. 对肌肉施加850 mOsm高渗盐水进行1秒的压力喷射，可引发异步的微小突触电流群，代表囊泡的易释放池。

讨论

遗传模式生物 C. elegans 非常适合通过分析编码突触蛋白的基因突变来研究突触传递。本文介绍了一种解剖技术，使 C. elegans 的神经肌肉接头（NMJs）可用于电生理分析。配套视频展示了 C. elegans 解剖过程中的关键步骤以及用于记录突触活动的典型记录配置。学习该技术最具挑战性的三个步骤是：1）固定线虫步骤，2）成功完成切口，3）在体壁肌细胞上形成膜片钳。一旦掌握这些步骤，即可在电压钳或电流钳模式下记录突触后肌细胞的反应。利用这种解剖制备方法，可在多种突变背景下便捷地测量诱发刺激的反应。鉴于野生型成年线虫本身体积已非常微小（体长约为 1 mm），那些无法发育至成虫阶段或体型瘦小的突触突变体可能不适用于此解剖方法。腹神经索中的运动神经元也非常微小（胞体直径为 2–5 μm），对电生理记录人员提出了额外挑战，尽管已有多个实验室成功地在此类解剖制备的基础上，对 C. elegans 神经元进行了电生理记录^{5 6}。