痘苗病毒侵染及病毒基因表达的时间进程分析：第一部分

摘要

HeLa 细胞的痘苗病毒感染实验方案及宿主与病毒基因表达分析。第 1 部分（共 3 部分）。

摘要

该科Poxviridae由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科的成员包括orthopox属包括引起人类天花的病原体——天花病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒（VAC），后者是该病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但每一类在病毒生命周期中发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了用痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

方案

第1部分：建立感染模型

1. 在培养瓶中培养 HeLa 细胞，直至细胞融合度达到约 80%。
2. 为实验准备足量的病毒生长培养基：含 2% 胎牛血清（FBS）且不添加抗生素的常规 DMEM 培养基。
3. 感染可使用已知滴度的粗制痘苗病毒原液，或使用已知滴度的蔗糖纯化病毒；若关注宿主基因表达，建议使用后者。
4. 若使用蔗糖纯化病毒，可直接进入第 2 部分。
5. 若使用粗制痘苗病毒原液，在感染前需将病毒分装样品置于盛有冰水混合物（以冰为主，加少量水）的杯状超声仪中进行超声处理。
   • 以约 30 W 功率超声处理 20 秒。
   • 涡旋混匀后重复超声处理共 3 次，过程中根据需要添加冰块，确保超声杯始终被冰紧密填充并保持低温。
   • 每次超声处理之间均需进行涡旋混匀。
   • 完成后进入第 2 部分。
6. 或者，若无杯状超声仪，可将等体积的粗制病毒原液与 0.25 mg/mL 胰蛋白酶混合。
   • 剧烈涡旋混匀。
   • 将病毒原液与胰蛋白酶的混合物置于 37°C 水浴中孵育 30 分钟。
   • 每 5–10 分钟涡旋一次。
   • 完成后进入第 2 部分。

第二部分：感染细胞

1. 计算感染单层细胞所需的病毒颗粒数量，以达到预期的感染复数（MOI）。通常，在进行感染时间进程实验时，使用较高的感染复数（MOI 介于 5 至 10 之间）。
2. 将所需量的蔗糖纯化病毒或胰蛋白酶处理的粗制病毒加入 37°C 的病毒生长培养基中，并充分混匀。所用培养基的量应足以覆盖培养瓶底部即可。例如，T-175 培养瓶使用 10 mL 培养基。
3. 移除细胞中的培养基，并用室温 PBS 洗涤一次。
4. 将病毒/病毒生长培养基加入每个培养瓶中。
   • 轻轻摇晃，倾斜培养瓶，然后在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时。
   • 每 15 分钟倾斜并摇晃一次培养瓶，以使病毒均匀分布并保持细胞湿润。
   • 对于 0 小时/模拟感染（Mock）时间点，仅加入病毒生长培养基，不添加病毒。
5. 1 小时孵育后，移除含病毒的培养基，并用室温 PBS 洗涤三次。
6. 向每个培养瓶中加入最大量的病毒生长培养基。例如，T-175 培养瓶加入 30 mL 培养基。从此刻开始计为 0 小时时间点。

第3部分：收集细胞

1. 在显微镜下观察细胞，并记录任何细胞病变效应（CPE）。
2. 移除培养基，并用30 mL室温的PBS冲洗细胞。
3. 向细胞中加入15 mL胰蛋白酶，于37°C孵育2-5分钟。
4. 在显微镜下检查细胞是否脱落，并轻轻敲击培养瓶以使细胞脱离。
5. 用无菌血清移液管将细胞转移至50 mL锥形管中。
6. 用等体积的细胞生长培养基洗涤培养瓶，并将该培养基加入锥形管中的胰蛋白酶处理细胞中。
7. 在室温下以300 × g 离心5分钟。
8. 移除细胞沉淀中的胰蛋白酶/培养基。
9. 将细胞沉淀重悬于TRIzol试剂中，或重悬于所选RNA提取试剂盒的裂解缓冲液中。
10. 若使用TRIzol，将样品分装为每管1 mL，置于已标记的1.5 mL离心管中，并于-80°C冷冻保存。
11. 对所有时间点重复上述操作，每个时间点收获一个培养瓶。

第4部分：使用TRIzol提取样品中的RNA

1. 此时，您的样品应已重悬于TRIzol试剂中，可进行后续处理。
2. 每1 mL TRIzol加入200 µL BCP相分离试剂。如果起始使用的TRIzol体积较大，可能需要将样品转移至更大的离心管中。
3. 充分涡旋或剧烈震荡，并在室温下孵育2–3分钟。
4. 在12,000 × g条件下离心15分钟。
5. 将水相转移至新的离心管中。水相为上层透明液体。每1 mL起始TRIzol应可回收约600 µL水相。
6. 进行第二次酚/氯仿抽提，此次每1 mL TRIzol使用500 µL氯仿，代替BCP试剂。
7. 充分涡旋或剧烈震荡，并在室温下孵育2–3分钟。
8. 在12,000 × g条件下离心15分钟。
9. 将水相转移至新的离心管中。水相为上层透明液体。
10. 向每个样品中加入20 µg线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺作为载体，有助于RNA沉淀。
11. 每1 mL起始TRIzol加入500 µL异丙醇，充分混匀。
12. 在室温下孵育10分钟。
13. 在微量离心机中以最大转速离心10–15分钟。
14. RNA沉淀将可见于管底。请非常小心地用真空抽吸装置或移液器手动去除上清液，切勿扰动沉淀。
15. 用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。
    • 向沉淀中加入1 mL 70%乙醇。
    • 在14,000 × g下高速离心5–7分钟。
    • 非常小心地用真空抽吸装置或移液器手动去除乙醇。检查确认沉淀仍位于管底。
    • 弃去上清液。
16. 重复洗涤步骤。弃去上清液后，在管壁上标记沉淀位置。
17. 将沉淀在空气中干燥，时间不超过5分钟。切勿过度干燥，否则RNA将难以重悬！
18. 如需进行可选的DNase处理以去除样品中残留的DNA，请将沉淀重悬于17 µL无核酸酶水中；否则，将沉淀重悬于20 µL无核酸酶水中，并继续进行第22步。
19. （可选DNase处理）使用Qiagen无RNase的DNase试剂盒，向重悬的RNA中加入2 µL Buffer RDD和1 µL重悬的无RNase DNase I，轻轻混匀。
20. （可选DNase处理）在37°C孵育30分钟。
21. （可选DNase处理）加入2 µL 2.5 mM EDTA，在65°C孵育5分钟以灭活DNase。切勿超过该灭活时间或温度，否则可能导致RNA降解。
22. 使用分光光度计检测RNA浓度。
23. 将RNA样品储存于-80°C。
24. （可选质量控制）使用Agilent BioAnalyzer检测RNA质量，或通过变性凝胶电泳分析样品并检测OD值（260 nm及260/280比值）。

讨论

关键步骤

第1和第2部分

建立同步性痘苗病毒感染有几个关键步骤，第一步是仔细对病毒进行超声处理（或胰蛋白酶处理），以使病毒颗粒解聚。痘苗病毒极易发生聚集，因此破坏病毒颗粒对于确保细胞感染的均匀性至关重要。为了实现同步感染，应使用较高的感染复数（MOI 大于 2），以确保每个细胞都被感染。若存在感染细胞与未感染细胞的混合，将导致多轮感染、时间点的异质性混合，以及病毒和宿主转录反应的异步发生。感染过程中应使用最少量的培养基，以促进病毒最大限度地吸附到细胞上。此外，定期摇动培养瓶或培养皿（每 10 分钟一次）有助于病毒在培养容器内的均匀分布，并防止细胞干燥。

第4部分

使用1-溴-3-氯丙烷（BCP）替代苯酚以减少基因组DNA的污染。后续可选择性地进行DNA酶处理（Qiagen RNA酶-free DNA酶），以彻底清除残留的基因组DNA。第二次氯仿抽提用于去除提取物中残留的微量有机溶剂，因为即使痕量的有机溶剂也可能抑制后续的扩增...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TRIzol 试剂	试剂	Invitrogen	15596-026	类似试剂（如 Roche 的 TriPure）也可使用。
BCP 相分离试剂	试剂	Molecular Research Center	BP151
无 RNase 的 DNase 试剂盒	试剂	Qiagen	79254	DNase 处理为可选步骤。