痘苗病毒侵染及病毒基因表达的时间进程分析：第一部分

摘要

HeLa 细胞的痘苗病毒感染实验方案及宿主与病毒基因表达分析。第 1 部分（共 3 部分）。

摘要

该科Poxviridae由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科的成员包括orthopox属包括引起人类天花的病原体——天花病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒（VAC），后者是该病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但每一类在病毒生命周期中发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了用痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

方案

第1部分：建立感染模型

1. 在培养瓶中培养 HeLa 细胞，直至细胞融合度达到约 80%。
2. 为实验准备足量的病毒生长培养基：含 2% 胎牛血清（FBS）且不添加抗生素的常规 DMEM 培养基。
3. 感染可使用已知滴度的粗制痘苗病毒原液，或使用已知滴度的蔗糖纯化病毒；若关注宿主基因表达，建议使用后者。
4. 若使用蔗糖纯化病毒，可直接进入第 2 部分。
5. 若使用粗制痘苗病毒原液，在感染前需将病毒分装样品置于盛有冰水混合物（以冰为主，加少量水）的杯状超声仪中进行超声处理。
   • 以约 30 W 功率超声处理 20 秒。
   • 涡旋混匀后重复超声处理共 3 次，过程中根据需要添加冰块，确保超声杯始终被冰紧密填充并保持低温。
   • 每次超声处理之间均需进行涡旋混匀。
   • 完成后进入第 2 部分。
6. 或者，若无杯状超声仪，可将等体积的粗制病毒原液与 0.25 mg/mL 胰蛋白酶混合。
   • 剧烈涡旋混匀。
   • 将病毒原液与胰蛋白酶的混合物置于 37°C 水浴中孵育 30 分钟。
   • 每 5–10 分钟涡旋一次。
   • 完成后进入第 2 部分。
....

讨论

关键步骤

第1和第2部分

建立同步性痘苗病毒感染有几个关键步骤，第一步是仔细对病毒进行超声处理（或胰蛋白酶处理），以使病毒颗粒解聚。痘苗病毒极易发生聚集，因此破坏病毒颗粒对于确保细胞感染的均匀性至关重要。为了实现同步感染，应使用较高的感染复数（MOI 大于 2），以确保每个细胞都被感染。若存在感染细胞与未感染细胞的混合，将导致多轮感染、时间点的异质性混合，以及病毒和宿主转录反应的异步发生。感染过程中应使用最少量的培养基，以促进病毒最大限度地吸附到细胞上。此外，定期摇动培养瓶或培养皿（每 10 分钟一次）有助于病毒在培养容器内的均匀分布，并防止细胞干燥。

第4部分

使用1-溴-3-氯丙烷（BCP）替代苯酚以减少基因组DNA的污染。后续可选择性地进行DNA酶处理（Qiagen RNA酶-free DNA酶），以彻底清除残留的基因组DNA。第二次氯仿抽提用于去除提取物中残留的微量有机溶剂，因为即使痕量的有机溶剂也可能抑制后续的扩增.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TRIzol 试剂	试剂	Invitrogen	15596-026	类似试剂（如 Roche 的 TriPure）也可使用。
BCP 相分离试剂	试剂	Molecular Research Center	BP151
无 RNase 的 DNase 试剂盒	试剂	Qiagen	79254	DNase 处理为可选步骤。