通过使用 Jonah 螃蟹（C. borealis）的口胃神经系统（STNS），可开展电生理学、免疫组织化学以及细胞培养研究。STNS 的提取分为两个步骤：粗解剖和精细解剖。
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本文内容
摘要
摘要
口胃神经节（STG）是研究细胞与网络相互作用的优良模型，因为它所含的细胞数量相对较少（在C. borealis中约有25个），且这些细胞已被充分表征。STG中的细胞表现出多种输出模式，负责调控胃部的运动功能。胃部分为胃磨和幽门：胃磨通过三个内部齿状结构将食物破碎，而幽门则在食物进入中肠前对其进行过滤。STG产生两种节律性输出，分别控制胃磨和幽门，这类输出被称为中枢模式发生器（CPGs）。STG中的每个细胞均可参与其中一种或两种节律活动。这些中枢模式发生器为研究神经调制、稳态、细胞与网络的变异性、网络发育以及网络恢复提供了理想系统。
从乔纳蟹（Cancer borealis）中分离口胃神经系统（STNS）的过程分为两个步骤：粗略解剖和精细解剖。在粗略解剖过程中，将整个胃从蟹体内完整取出；在精细解剖过程中，使用解剖显微镜和显微解剖工具从胃组织中分离出STNS（见图1）。STNS包括口胃神经节（STG）、食道神经节（OG）、连合神经节（CoG），以及支配胃部肌肉的神经。本文介绍了为进行电生理实验而完整解剖STNS的方法，其中将对STG中的细胞进行细胞内记录，并利用外周神经进行细胞外记录。文中还展示了准确定位目标神经的正确技术，以及我们去除神经节鞘膜以暴露细胞体和神经纤维网的技术。
方案
1. 大体解剖
- 将一只螃蟹置于冰上30分钟，以降低其感觉和运动系统的敏感性。需用冰块从各个方向包围螃蟹。操作螃蟹时应佩戴手套。
- 准备进行大体解剖，铺好解剖盘并摆放所需工具。需要的工具有：咬骨钳、骨剪、小剪刀、有齿镊子、带锥形边缘的刮匙、黑色硅胶涂层培养皿以及昆虫针。
- 通过抓住螃蟹的后腿将其从冰桶中取出，以防被夹伤，然后将其放入解剖盘中。
- 先将螯足逐一向内扭转取下，再以同样的扭转动作取下每条步足。
- 使用咬骨钳去除覆盖口器的上颚，并移除柔软的下颚须。
- 再次使用咬骨钳，从头胸甲的后外侧端开始，牢固夹住边缘，用力夹断并移除该部分头胸甲。确保移除足够的头胸甲，以便刮匙能够进入开口处。沿头胸甲边缘继续向复眼方向去除，另一侧重复相同操作。
- 用刮匙的锥形边缘轻轻刮除头胸甲背侧内面的软组织，操作时始终保持刮匙与头胸甲接触，以避免损伤胃神经系（STNS）。使用咬骨钳将已与组织分离的头胸甲碎片进一步去除。同时分离腹侧头胸甲上的部分软组织，特别注意分离将组织与头胸甲相连的闭壳肌。
- 从背侧向后方去除头胸甲，直至心脏位置，此处有两个从小骨片突出的骨化结构。尽可能向前方剪除。在去除最前部的背侧头胸甲时，用一根手指固定头节（“面部”）以保持稳定。
- 在头胸甲腹侧，逐个拔除下颌：将咬骨钳固定于一个下颌上，向外扭转以将其从附着的额角片上松脱，然后将其拉出。若操作正确，取出的下颌上应附有两个带肌肉的长条状小骨片。
- 使用刮匙分离靠近复眼处头节两侧的组织。用小解剖剪尽可能贴近骨嵴处，逐层剪断组织。
- 将螃蟹靠在解剖盘壁上并支撑固定（可用螯足辅助固定）。从额角处剪除唇瓣（“上唇”），确保无残留组织附着。使用骨剪在腹侧头胸甲上做两条对角切口，以取下头节。
- 用有齿镊子夹住唇瓣，从腹侧骨片上剪除下唇瓣（“下唇”）。然后轻轻将下唇从剩余的腹侧头胸甲上提起。使用小剪刀将胃的腹侧部分与头胸甲内壁的组织分离。当幽门盲囊可见时，从其两侧切断胃部组织，直至将整个胃从螃蟹体内取出。
- 仍用镊子夹住胃的唇部，将胃靠在手掌上，向口中灌注生理盐水。这会使胃膨胀，便于后续切开。从口部开口处开始，沿幽门正中间穿过两盲囊之间的骨片向下剪开。然后斜向剪开两个心部分支。剪除胃内三个齿状结构的尖端。
- 将胃组织内面朝下放置在一个较大的黑色硅胶涂层培养皿中。用昆虫针将标本的五个角固定住，并用冷生理盐水充满培养皿，完全浸没整个标本（见图1）。
2. 精细解剖
- ，精细解剖需要使用显微解剖工具。特别需要镊子、弹簧剪以及带钨针的针 holder。还应准备一个透明的、涂有Sylgard的培养皿和一些细金属丝针。
- 从最低放大倍数开始，首先固定靠近唇部、原为口 opening 的瓣膜。调整其余大头针的位置，使标本绷紧，并根据需要固定其他必要区域。
- 小心抬起覆盖在制备物下部的带有斑点的皮下组织，横向剪去多余部分，留下一块带有两个白点的皮下组织小片。
- 剥离制备样本底部附近的黄色、纤细、膜状组织。 mvns 微弱地附着于该组织的下表面。小心分离 mvns 从拉起的黄色组织处分离，沿脑组织旁剪开。
- 沿着从脑部向外侧延伸的粗大神经束追踪，这些即为连合神经。当到达连合神经末端时，移除已从脑侧切离的海绵状、略带灰白色的组织团块。
- 何处的 离子 和 儿子们 满足CoGs，切除肌肉和组织以暴露其全长 离子 和 儿子们.
- 返回斑点状的皮下组织区域并将其剪除。这将在围绕STG的动脉上留下一个开口。通过该开口进行剪切，以分离位于STG两侧的两块肌肉。提起这两块肌肉的末端，并在其下方紧贴处剪开，使其与动脉分离，从而暴露 alns 和 agns. 将覆盖于软骨上方的侧翼肌肉向上分离至软骨处 stn.
- 切除围绕STG的动脉组织，直至 mvns, dgn, 和 dvn 向下切至腰椎神经，切开覆盖其上的浅白色细薄组织 lvns.
- 定位 psn 听小骨近制备底部处。可利用psn进行定位 lvn 和 dlvn 连接处
- 接下来按照 dlvn 向下以定位 pyn 和 pdnpyn 常延伸至幽门壶腹并包裹至开口处。 pdn 分出的分支 dlvn 位于幽门壶腹与心-幽门瓣肌肉之间。在其中一条神经上保留部分肌肉组织，因为在将标本转移至透明的Sylgard培养皿时，这些神经容易混淆。
- 当所有神经均暴露后，切断STNS与胃部组织及无关神经之间的任何残留连接。小心地将STNS从胃的其余部分分离，剪断任何遗漏的连接。
- 用剩余的胃组织在Sylgard培养皿表面轻轻擦拭，对透明的Sylgard培养皿进行预处理，直至其表面不再过于黏腻或干燥。Sylgard具有疏水性，若未经过此步骤处理，STNS会强烈黏附于Sylgard包被的培养皿表面。
- 向培养皿中加入一些冷生理盐水。用镊子夹住连合神经的上端，将STNS移至干净的Sylgard培养皿中。
- 将STNS固定在Sylgard上。切断脑部与神经连合之间的连接，并使用微细图钉先将CoGs的四个末端固定住。通过检查确认制备物正面朝上， ivn 指向远离Sylgard的方向。 dgn 当颞上回（STG）正面朝上时，应使其末端略低于STG下方。用细金属针将其余神经末端固定。
- 清除STNS上残留的任何肌肉或组织。
- 使用持针器和略微弯曲的细钨针剥离STG。在STG鞘膜远离细胞体的一角刺一个小孔，并利用该孔插入至鞘膜各层之间。小心切开已分离的鞘膜瓣，以暴露STG神经网和细胞体。
- 将神经鞘的任何瓣状部分用图钉固定，以增加对细胞体的可及性，并为细胞内记录稳定固有咽侧神经节（STG）。重新固定其余的STNS，确保每条神经拉紧且间距适宜，以便进行细胞外记录（见图3）。
3. 结果
- 理想情况下，所有神经均应无切口和损伤，尤其是需要进行记录的神经。神经不得缠绕或扭曲。胃中神经节（STG）应保持完整，所有细胞围绕神经髓呈胡须状排列。完整的STNS具有双侧对称结构，外形类似小人图，其中lvns作为其 腿， mvns 将肢体和前端视为头部。
缩写：
| STNS | 口胃神经系统 |
| STG | 口胃神经节 |
| CoG | 连合神经节 |
| OG | 食管神经节 |
| mvn | 中腹侧神经 |
| ion | 下食管神经 |
| son | 上食管神经 |
| agn | 前胃神经 |
| aln | 前外侧神经 |
| dgn | 背胃神经 |
| dvn | 背腹侧神经 |
| lvn | 外侧腹侧神经 |
| psn | 后胃神经 |
| pyn | 幽门神经 |
| pdn | 幽门扩张神经 |
| dlvn | 外侧腹侧神经的背支 |
| ivn | 下腹侧神经 |
图1：示意图显示在解剖前胃中 STNS 的大致位置。
图2：胃下部各肌肉的示意图，以及浅绿色叠加显示的STNS。图中列出了STG中每种细胞类型所支配的肌肉。在计划解剖携带特定细胞信号的神经时，该图谱非常有帮助（由Nadim实验室提供）。
图 3: STNS 的示意图，显示细胞内电极和细胞外记录井（引自 Marder 和 Bucher，2007）。
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讨论
STNS 解剖是进行电生理学或免疫组织化学实验，或获取细胞用于细胞培养的第一步。无论计划进行何种实验，大体解剖步骤均保持不变。然而，精细解剖可能有所不同。重要的是需提前规划好需要从中记录信号的细胞和神经。STG 中大多数神经元具有支配胃部至少一块肌肉的突起（见图2），并根据其支配的靶器官进行分类。因此，需要进行细胞外记录，以完全确认正在进行细胞内记录的细胞身份。幽门节律的频率和稳定性用于监测标本的健康状况。因此，许多实验包括对 lvn 的细胞外记录。dgn 常用于监测胃节律。stn 通常对大多数实验至关重要，因为 STNS 前端含有大量调制性细胞，切断该神经可能导致幽门节律和胃节律停止或变得不规则。
尽管精细解剖步骤的顺序并不重要，但我们发现，在将STG与周围组织分离之后，再松开外周神经末端与肌肉的连接，能够更轻松地完整取出STNS。这种方法可使STG和stn保持足够的张力，从而安全、便捷地去除其周围的肌肉和组织。
当制备好的标本置于透明的Sylgard培...
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致谢
我们衷心感谢Marder实验室的各位成员。感谢我们的导师Eve Marder博士给予的支持与鼓励。本研究得到了美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目NS-17813和NS-058110的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 黑色Sylgard 170 | 其他 | Dow Corning | 170 | 大体解剖 |
| 精细剪刀 | 手术 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| 6号昆虫针 | 手术 | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| 梅奥剪刀 | 手术 | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| 微型刮匙 | 手术 | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| 咬骨钳 | 手术 | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| 组织镊 | 手术 | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 精细钨丝（直径0.001英寸） | 手术 | California Fine Wire Company | 精细解剖 | |
| 5号精细镊 | 手术 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 微型固定针 | 手术 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria弹簧剪（7mm刀片） | 手术 | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| 培养皿（100×15 mm） | 其他 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 持针器 | 手术 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 超精细镊#5SF | 手术 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | 其他 | Dow Corning | 182 | |
| 钨针 | 手术 | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| 解剖显微镜 | 显微镜 | Wild | MC3 | 其他 |
| 乔纳蟹（C. borealis） | 动物 | Commercial Lobster |
参考文献
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
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重印与许可
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