斑马鱼脑室注射

摘要

神经管形成后，神经上皮发生收缩和折叠，同时神经管内充满胚胎期脑脊液（eCSF），从而形成胚胎脑室。我们开发了这种脑室注射技术，以更清晰地在活体胚胎中区分液体充盈的空间与神经上皮的形态。

摘要

在胚胎脑发育过程中，脑室的正常形成对于脑功能的建立至关重要。脑室是脑内高度保守的腔隙，充满脑脊液。在斑马鱼中，神经管形成后，神经上皮在充满液体的同时经历一系列收缩和折叠，最终形成脑室。为了理解脑室形成的过程以及伴随发生的神经上皮形态变化，我们需要一种能够将脑室腔隙与脑组织进行对比观察的方法。然而，由于斑马鱼胚胎具有透明特性，难以区分组织与脑室腔隙。因此，我们建立了一种脑室注射技术，将荧光染料注入脑室腔内，再通过明场显微镜和荧光显微镜进行成像。随后在Photoshop中对明场图像和荧光图像进行处理并叠加。该技术可实现荧光染料标记的脑室腔隙与明场图像中神经上皮形态之间的对比可视化。斑马鱼脑室注射技术适用于受精后18小时至早期幼虫阶段。我们已在脑室形成与形态发生研究以及脑形态发生突变体的表征中广泛使用该技术（1-3）。 关键词：脑室形成，神经上皮，斑马鱼，脑发育，荧光染料注射，明场显微镜，荧光显微镜，形态发生

方案

实验方案

第1部分：微注射前的准备

1. 使用 Sutter Instruments 针头拉制仪拉制毛细管针，为注射做好准备。
2. 用荧光染料（如 Texas-Red Dextran）填充针头。
3. 将针头安装到显微操作器和显微注射装置上。
4. 以适当角度将针头切割至合适尺寸，形成斜面尖端。
5. 测量液滴大小，并确保在油中每次注射的体积为 1–2 nl。

第二部分：准备胚胎

1. 在目标时期前30分钟注射胚胎。例如，若要研究受精后24小时（hpf）的脑室，应在23.5 hpf时注射胚胎。胚胎分期依据Kimmel等人的方法（4）。
2. 在体视显微镜下，使用镊子小心去除胚胎的绒毛膜。
3. 使用涂有1%琼脂糖的塑料培养皿，用塑料1-200 μl移液器吸头在琼脂糖上打孔，并用镊子小心取出孔中的琼脂糖塞。
4. 将胚胎连同胚胎培养基一起转移至带孔的琼脂糖培养皿中。
5. 向培养基中加入三卡因（按Westerfield方法配制（5）），以麻醉胚胎并防止实验过程中胚胎移动。
6. 轻轻将胚胎尾部朝下放入孔中，并调整方向，使注射装置位于胚胎的后侧。

第3部分：脑室注射

1. 为注射脑室，调整显微操作装置，使在高倍镜下针尖与胚胎处于同一视野中。
2. 小心地将针头穿过位于r0/r1铰接点后方的后脑薄层顶板，注意不要触碰到下方的脑组织。
3. 注射适量染料，直至完全充满脑室。根据胚胎发育阶段的不同，可能需要多次注射才能填满脑室空间。

第4部分：成像

1. 使用干净的1%琼脂糖包被培养皿，在培养皿上打新的孔，移除凝胶塞，并加入三卡因以麻醉胚胎并防止其移动。
2. 将心室注射后的胚胎尾部放入孔中，调整位置以获取背侧图像。
3. 使用透射光拍摄图像。
4. 切勿移动胚胎或显微镜，这一点至关重要。
5. 更改显微镜设置，使用荧光光源拍摄图像。
6. 重新定位胚胎，分别用透射光和荧光光源拍摄侧向图像。
7. 将图像保存为TIFF文件，用于在Photoshop中进行图像处理。

第5部分：图像处理

1. 在 Photoshop 中处理图像时，打开同一胚胎在相同位置拍摄的透射光图像和荧光图像。确保每幅图像的所有设置完全相同。
2. 将荧光图像拖动到透射光图像上，并精确对齐。
3. 选中荧光图像后，选择“图像”、“调整”，然后选择“替换颜色”，将黑色背景更改为白色。
4. 在“替换颜色”窗口中，向右调整“容差”值，直到荧光图像的颜色看起来均匀一致。
5. 在“图层”窗口中选择“正片叠底”模式以查看叠加图像。此时心室腔图像应与透射光图像完全匹配。
6. 保存该文件，并对其他图像重复上述步骤。

代表性结果/成果

正确的脑室注射图像如图1的A-D所示，而E-H则展示了错误注射的示例。正确的注射应具有清晰的边界且染料不弥散。当针头插入过深，刺入脑室下方的脑组织时，会导致错误的注射，此时染料可出现在脑室外腔隙及卵黄中。

图1. 25小时受精龄野生型胚胎的脑室注射。 （A-D）显示正确的注射方法，（E-H）显示错误的注射方法作为示例。（A, E）为背侧明场图像，对应的荧光图像为（B, F），以及荧光图像与明场图像的叠加图（C, G），分别展示正确与错误的注射方法。箭头指示由于脑室注射不当导致染料溢出至脑室腔外的区域（参见“故障排除”）。所有图像中，头端朝左。

故障排除：

问题	原因	解决方法
您正在用针头压碎胚胎。	您的针头过于钝化，或针尖过大。	更换新的针头，且折断位置不宜过靠后。将针头磨出斜面，使其像注射器针头一样锋利。
染料扩散至整个胚胎及卵黄中（见图1E-H）。	您的针头已穿透组织，未能停留在脑室腔内。	您的针头可能不够锋利，导致无法控制穿刺速度。
染料信号过弱或未到达前脑。	注射时压力不足，或注射时针头位置不够靠前，未能到达前脑区域。	增加注射压力，或在注射时将针头稍微前移。如需更清晰的前脑标记，可将针头穿过中脑-后脑边界。此外，也可在成像前稍作等待，使染料进一步扩散。
在 Photoshop 中进行颜色替换后，荧光图像边缘区域变暗。	您未调整“颜色替换”窗口中的“容差”（fuzziness）设置。	在颜色替换窗口中，将“容差”（fuzziness）滑块完全调至最右侧。
针头无法刺穿后脑顶板。	您的针头切割不当。	重新制作一根新针头。若需进行大量注射，建议准备多根针头，因其易变钝。

讨论

在本视频中，我们演示了如何将荧光染料（Texas-Red Dextran）注射到斑马鱼发育中的脑室中。该方法可用于可视化脑室腔隙，以区别于周围的神经上皮组织，对于确定脑室腔隙的形态以及周围脑组织的形状极为有用。该技术使我们能够更好地理解活体胚胎在发育过程中脑室形成及脑形态发生的动态过程。此技术是研究脑室形成缺陷以及对脑形态发生突变体进行初步鉴定和研究的有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子	工具	Fine Science Tools	11252-20
毛细玻璃管（针头）	工具	Frederick Haer and Co.	30-30-1
琼脂糖包被培养皿	工具	琼脂糖（Seakem GTG；Lonza）培养皿（Corning）	琼脂糖（50027）培养皿（430166）	根据所注射胚胎的发育阶段，将琼脂糖倒入培养皿中，厚度约为 2–3 mm
体视显微镜	显微镜	Carl Zeiss, Inc.
具备荧光功能并配有图像采集软件的显微镜相机	工具
1–200 μ 移液器吸头	工具	USA Scientific, Inc.	1111-0806	此规格吸头非常适合在琼脂糖上打孔，并使胚胎恰好嵌入孔中。
Photoshop	图像分析	Adobe
胚胎环	工具			可使用玻璃移液管和毛发或钓鱼线自行制作，并用蜂蜡密封。
显微注射仪	工具	Harvard Apparatus	PL1-100
拉针仪	工具	Sutter Instrument Co.		设置参数（加热 785，拉力 70，速度 40，时间 70）。
显微操作器	工具	Narishige International
荧光染料 Texas-Red 葡聚糖 70,000MW	试剂	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	如需要，也可选用其他分子量的染料。
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）	试剂	Sigma-Aldrich	A-5040
胚胎培养液	试剂			参照 Westerfield (5) 的配方