平滑肌中局灶性 Ca2+ 瞬变的检测

摘要

详细介绍在离体器官中对平滑肌进行高分辨率 Ca²⁺ 成像的方法，包括：组织制备、图像采集和数据分析。

摘要

平滑肌的 Ca²⁺ 成像可揭示那些可能不引起膜电位变化的细胞机制，例如细胞内钙库的 Ca²⁺ 释放，并可同时监测多个细胞，以评估例如合胞体组织中的细胞耦联情况。亚细胞水平的 Ca²⁺ 瞬变在平滑肌中较为常见，但由于其随机发生、视野通常较广，且器官本身易于收缩，因此难以准确测量。为解决这一问题，我们开发了一系列成像方案和分析流程，能够以自动化方式获取并分析此类事件的频率、位置和幅度。尽管该方法可应用于其他情境，但我们自身的工作主要涉及检测局部嘌呤能性 Ca²⁺ 瞬变，以亚微米分辨率定位神经递质释放位点。

ATP 作为共递质从自主神经末梢释放，与膀胱逼尿肌和输精管平滑肌上的 P2X1 受体结合。Ca²⁺ 进入平滑肌细胞，产生嘌呤能神经效应器 Ca²⁺ 瞬变（NCTs）。这种局灶性 Ca²⁺ 瞬变使得能够以光学方式监测神经递质的释放，该方法相较于电生理学具有诸多优势。除了显著提高的空间分辨率外，光学记录的另一优势在于可同时记录来自多个可区分位点的递质释放。此外，在长时间记录过程中，维持或调整光学焦平面比重新定位细胞内锐利微电极更为简便。

综上所述，本文概述了一种Ca²⁺荧光成像方法，详细介绍了组织制备、数据采集与分析过程。我们还阐述了多个用于分析此类Ca²⁺瞬变信号的脚本的使用方法。

方案

第1部分：Ca²⁺指示剂（Oregon Green 488 BAPTA-1 AM）的配制

1. Oregon Green 488 BAPTA-1 AM 以小瓶装形式提供，每瓶 500 μl，内含少量粉末（50 μg）。向粉末中加入 40 μl Pluronic F-127 溶液，轻轻振荡 30 秒，然后加入 460 μl PSS，再轻轻振荡 30 秒。最终得到 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM 溶液，可分装为 4 份，每份 125 μl。避光保存于 -20 °C。

第二部分：Ca²⁺ 负载

1. 从（-20 °C）冰箱中取出Ca²⁺指示剂（Oregon Green 488 BAPTA-1 AM），置于室温下解冻。
2. 取1 ml PSS放入试管中，并置于水浴中。以约每秒1个气泡的速度通入95% O₂ / 5% CO₂混合气体。需将通气装置固定于试管中，例如使用橡胶塞或Parafilm密封。
3. 从动物体内分离组织，在铺有Sylgard的培养皿中仔细去除结缔组织。无论平滑肌器官类型如何，每10分钟应更换一次PSS，并在解剖后充分洗涤组织（例如，更换PSS三次）。对于输精管：可考虑沿纵轴切开，制成片状组织。对于膀胱：从膀胱颈（后部）沿纵行切开至穹顶顶部（前部）。沿逼尿肌背侧表面制备四条组织条，每条长6–8 mm，宽1–2 mm，切割方向应与主要肌束走向一致。
4. 将解剖好的组织置于“预温并持续通气”的PSS中。
5. 向试管中加入125 μl的10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM溶液，用手轻轻振荡混匀。
6. 恢复通气，并用铝箔覆盖避光孵育。组织充分摄取Ca²⁺指示剂所需时间因组织大小和平滑肌层厚度而异。例如：小鼠逼尿肌、大鼠肛尾肌约需70分钟，大鼠逼尿肌、小鼠输精管则需120分钟。

第3部分：为显微镜检查准备“Ca²⁺ 负载”的组织

必须仔细固定组织，以尽量减少组织的自发运动（这是对相对完整组织中的平滑肌细胞进行成像时的一个特性），并有助于定位合适的成像位置（因为平整的组织样本可在二维而非三维范围内进行观察）。

1. 用持续通气的PSS溶液冲洗组织至少5分钟。
2. 将组织展平并固定于涂有Sylgard的制备皿中，轻微拉伸组织使其形成平整的薄片。避免使用过长的“针”以免划伤物镜；建议使用短段直径为25-50 μm的银丝作为“针”，并以一定角度插入。
3. 将制备皿置于显微镜载物台上，注意确保PSS不会溢出Sylgard涂层区域（否则在开始灌流时可能导致大面积被PSS覆盖）。
4. 启动泵以对组织进行PSS灌流。通常采用的流速为每小时100 ml。
5. 打开加热装置。
6. 将进液管、出液管和温度探头放置在制备皿上（通过其底部的磁铁将各部件固定在金属条上）。出液管管口的高度将决定PSS的液面深度。需注意确认出液管确实在排出PSS（因有时初始阶段可能未有效排出）。
7. 调节加热装置的温度设定至所需温度，例如33–35 °C。
8. 让组织至少平衡10分钟。

第4部分：成像位点的选择

暴露于激发光照会使指示剂发生光漂白，因此应避免每次使用超过几秒钟。

1. 使用低倍物镜（10x 或 20x），在落射荧光下用蓝光激发，观察平滑肌并确定一个合适的监测区域。选择成像位点时需考虑以下因素：运动程度（应尽可能小）以及视野中平滑肌细胞的数量。明亮的“结构”可能会在图像检测算法中产生大量“假阳性”信号，因此应避免选择含有大量（例如）散在的上皮细胞或成纤维细胞的区域。
2. 切换至高倍物镜（40x）。
3. 旋转载物台或光轴，使平滑肌细胞呈水平方向（即与快速扫描轴平行）。

第5部分：共聚焦显微镜

共聚焦显微镜的“设置”细节因显微镜类型而异，但关键考虑因素包括：速度（大多数Ca²⁺瞬变信号的检测至少需要5 Hz的采集速度）；分辨率和视场大小（这两者通常与速度相互权衡）。以下部分操作步骤针对Leica SP2直立式共聚焦显微镜。典型的操作方案为：以5 Hz采集100帧图像（256 × 256像素；约100 × 100 μm）或以13.5 Hz采集（256 × 64像素；约100 × 25 μm）。扫描头设置为双向扫描（以最大化采集速度），每行扫描速率为1000 Hz。

1. 将针孔关闭至一个“艾里斑”大小。
2. 在声光可调滤波器（AOTF）上将激光（488 nm）功率设置在25%至35%之间；该数值需在亮度与光漂白之间进行权衡（后者在长时间记录过程中尤为显著）。
3. 每个位点采集六组序列，每种“处理”条件包含四至六个位点。通常需在给药前（即“对照”）和给药后监测相同的六个位点，但若发生显著的光漂白，实验人员可能无法严格遵循此方案。
4. 进行Ca²⁺成像时，必须设置“时间对照”实验。

第6部分：分析前准备

1. 从以下网址下载并安装 Image J：http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html。下载适用于您操作系统的版本，然后通过从 http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar 下载最新的 imageJ.jar 文件并替换原有文件，将软件更新至最新版本。苹果 Mac 用户：如果运行速度较慢，请确保使用 Apple 提供的最新版本 Java 虚拟机（JVM）（http://www.apple.com/macosx/features/java/）。
2. 从以下网址下载 Excel_writer.jar：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html，并将其安装到 Plugins [目录] > jar 目录中。
3. 将以下文件复制到 Plugins 目录中：Leica_SP2_Stacker.class；JNCT0.08Release.ijm。使用 ImageJ 的 Plugins [菜单] > Macros > Install… 功能安装每个脚本。
4. 我们使用徕卡SP2共聚焦显微镜，其配套软件（Leica LCS）可在软件内将每一系列生成为单个可观看的“视频”，但以单独的帧形式保存。要将帧重新构建成序列，请执行以下步骤：（i）确保所有需重建的“帧”均位于同一文件夹中（例如“DataFolder > Tiffs”）。（ii）选择插件[菜单] > 宏 > Leica_SP2_Stacker。选择根目录（例如“DataFolder”）。从下拉列表中选择目标文件夹（例如“Tiffs/”）。选择输出目录或创建新目录（例如“DataFolder > Stacks”）。随后，该脚本将从单个帧重建序列。

第7部分：校正运动伪影

尽管通过良好的固定和均匀拉伸组织可以尽量减少成像部位的移动，但某些平滑肌器官会表现出自发性收缩，仅靠仔细固定无法完全消除。本文介绍了如何使用一种 freely available 算法，对图像序列中的各帧进行对齐或匹配。

1. 下载“StackReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）和“TurboReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）。
2. 使用“插件 > 宏 > 安装…”将每个插件安装到Plugins目录中。
3. 加载待处理的图像序列（文件 > 打开…），然后切换到一个能清晰显示目标区域的帧。其他帧将以此参考帧为基准进行对齐。
4. 插件 > 图像序列 > StackReg。尝试不同的“变换”方式（即平移、刚体、缩放旋转、仿射），以确定哪种方法最有效。（更多详情：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）

第8部分：粒子检测算法

对于每个成像的“位点”，影响Ca²⁺瞬变信号检测的因素各不相同。通过测量每个位点的某些特性（“颗粒参数”，详见下文），可促进检测过程。因此，针对每个位点，需计算“差值阈值”、“比值阈值”和“细胞边缘阈值”。

1. 插件 [菜单] > 宏 > 安装…，然后选择‘JNCT0.08Release.ijm’。
2. 插件 [菜单] > 宏 > 加载堆栈（快捷键：l）。选择一个序列并计算粒子参数：
   1. a. 用于减去的阈值（= 背景）
3. 在您认为是“背景”的区域上选择一个矩形感兴趣区域（ROI）。
4. 测量（快捷键：m）。记录下平均值（MEAN）。
   1. b. 计算比值的阈值
5. 在细胞的光学平坦区域周围选择一个矩形感兴趣区域（ROI）。
6. 测量（快捷键：m）。记录下平均值（MEAN）和标准差（STANDARD DEVIATION）。
7. 再重复两次，或者您可以通过按住‘shift’键一次性绘制三个框。
8. 计算并记录比值的阈值 = (1 + 标准差/平均值) × 32，并对三次重复/位点的数值取平均。
   1. c. 细胞边缘阈值
9. 图像 > 堆栈 > Z 投影… 选择投影类型：“平均强度”
10. 图像 > 调整 > 阈值。
11. 选择黑白模式。
12. 定义“下限”（上方滑块），并记录对应的数值（滑块右侧）。仅在黑色区域中发生的事件将被计数。
13. 点击“重置”。
14. 分析堆栈（快捷键：2）
15. 此阶段仅选择一个序列，即“第一个文件”和“最后一个文件”应相同。
16. 输入“用于减去的阈值”、“比值阈值”和“细胞边缘阈值”。其余设置保持默认值。
17. 算法将生成一个双窗格窗口，左侧显示处理后的序列，右侧显示原始图像。请仔细检查，评估假阳性事件的数量，以及肉眼可见但未被检测到的事件情况。为了更准确地检测Ca²⁺瞬变，可能需要轻微调整某些“粒子参数”。虽然初次尝试时该过程可能略显“试错”，但您会很快掌握哪些参数是关键的。
18. 对于每个序列，算法将生成一个Excel文件，详细列出所检测事件的特征（如幅度、面积和位置）。通过回顾算法输出的图像文件（例如步骤8.17）识别出的“假阳性”事件，可手动从该Excel文件中删除。

讨论

荧光 Ca²⁺ 指示剂的选择

选择Oregon Green 488 BAPTA-1 AM作为Ca²⁺指示剂，原因如下：（i）与其他指示剂（如Fluo-4和Calcium Green）相比，其荧光亮度更高¹；（ii）对细胞内Ca²⁺浓度[Ca²⁺]i生理变化敏感，其解离常数K_d与细胞内Ca²⁺浓度处于相似数量级¹（例如输精管组织²）；（iii）可有效加载至大量平滑肌细胞中，便于监测平滑肌细胞间的耦合情况。然而，Oregon Green 488 BAPTA-1 AM是一种非比率型Ca²⁺指示剂，因此难以用于测定绝对的[Ca²⁺]_i值。此外，当其浓度过高时，可能对Ca²⁺产生缓冲作用，并在[Ca²⁺]_i发生大幅度变化时出现荧光饱和现象。

抑制自发性收缩活动

平滑肌器官的自发性收缩可通过药物作用而降低，例如通过阻断L型Ca²⁺通道介导的Ca²⁺内流（如：硝苯地平³；地尔硫䓬⁴）。需注意，这些药物将显著降低全细胞Ca²⁺闪光/瞬变的幅度。

输精管的收缩主要由嘌呤能和去甲肾上腺素能神经传递共同介导。然而，该组织中的局灶性 Ca²⁺ 瞬变对去甲肾上腺素能受体阻断（例如，通过哌唑嗪阻断 α₁ 肾上腺素受体⁵）不敏感，因此可在不影响局灶性 Ca²⁺ 瞬变的情况下减少组织运动。

或者，可通过抑制肌球蛋白轻链激酶（例如使用渥曼青霉素）在“下游”阻止收缩⁶。

结论

以亚微米分辨率监测 Ca²⁺ 荧光是一种强大的技术，可用于研究神经递质释放的突触后效应^5,7以及细胞内储存库释放 Ca²⁺ 的过程（例如“钙火花”⁸）。与商业化的图像分析软件包相比，采用本文所述方法分析 Ca²⁺ 瞬变信号具有成本低的优势，并且可通过为 ImageJ 自定义编写的 Java 插件实现个性化分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 溶液	Invitrogen	P3000MP	二甲基亚砜中的 20% 溶液
Leica SP2 直立共聚焦显微镜	Leica Microsystems
气浮台（‘隔振工作台’）	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 弹性体	Dow Corning