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斑马鱼晶状体移植及其在眼突变体分析中的应用

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DOI：

10.3791/1258

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2009年6月1日

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1The Second Teaching Hospital of Jilin University, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

晶状体发育涉及与其他组织的相互作用。一些斑马鱼眼部突变体表现为晶状体尺寸异常偏小。本文中，我们展示了一项晶状体移植实验，以确定该表型是源于晶状体自身的内在因素，还是由于晶状体与周围组织之间相互作用缺陷所致。

摘要

晶状体在视杯的发育过程中起着重要作用[1,2]。利用斑马鱼作为模式生物，可以研究与晶状体发育相关的问题。斑马鱼因其多种有利特性，适用于遗传学研究，这些特性包括体型小、繁殖力高、生命周期短以及易于饲养。斑马鱼的晶状体发育迅速，在受精后72小时（72 hpf），其晶状体已功能成熟[3]。目前已有丰富的遗传和分子资源支持斑马鱼的相关研究。此外，斑马鱼眼睛与其他脊椎动物眼睛的相似性，使其成为研究人类眼部缺陷的优良动物模型[4-7]。多种斑马鱼突变体表现出晶状体异常，包括高水平的细胞死亡，某些情况下可导致晶状体组织完全退化[8]。

为了确定晶状体异常是源于内在因素还是与周围组织相互作用缺陷所致，可将突变型晶状体移植到野生型眼部中进行研究。使用火焰抛光的金属针，从供体动物中仔细分离出突变型或野生型晶状体，并将其转移至受体中。为了区分野生型和突变型组织，供体采用转基因品系，该品系在包括晶状体在内的所有组织中表达膜结合型GFP。这种移植技术是研究斑马鱼晶状体突变体的重要工具。

方案

第1部分：胚胎的制备

在本方案中，我们将使用 jjxy 符号来表示一种假设的斑马鱼晶状体突变体。

  1. 斑马鱼品系在标准鱼类养殖条件下维持，温度为 28.5 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗。
  2. 傍晚时，将斑马鱼品系 jjxy:AB/TU; tg(mGFP) 的雄鱼和雌鱼放入带有隔板的养殖缸中，使其相互隔离。该杂交后代将在所有组织中表达 GFP 转基因，用作供体。同时，采用相同方法设置非转基因野生型个体之间的杂交。根据实验目的，可选择在 jjxy 位点为野生型的个体作为供体或受体。
  3. 早晨光照开启后一小时内，移除隔板以允许鱼类交配。
  4. 交配后 15–30 分钟内，将胚胎收集至 100 × 15 mm 培养皿中，清洗胚胎并更换培养基（卵水）。
  5. 将胚胎置于 28.5 °C 培养箱中培养至所需时间点。
  6. 当准备进行移植时，使用两对尖头镊子手动去除胚胎的绒毛膜，并将胚胎在无钙 ZFR 中加入 0.2% EDTA 的溶液中孵育 30 分钟。

第2部分：解剖针的制备

  1. 移植操作需要两种类型的针：一种是尖头针，用于切割晶状体周围的组织、去除绒毛膜以及将胚胎从琼脂糖中释放出来；另一种是钝头针，用于移动供体晶状体并将其插入受体中。接下来我们将展示如何制作这些针。
  2. 首先，需使用金刚石刀切去巴斯德移液管的尖端。然后将一根玻璃毛细管插入巴斯德移液管的切口端，使其约一半长度插入其中。这样可以在下一步通过熔融玻璃固定钨丝时更易于固定。
  3. 接着将一根细钨丝从毛细管的开放端插入。用本生灯加热玻璃部分，使玻璃在钨丝周围熔化。用镊子夹住带有金属丝的一端，同时用手扭转针的另一端。软化的玻璃会螺旋缠绕在金属丝上，从而将其牢固固定。
  4. 如果制作的是钝头针，则此步骤即为结束。若要制作尖头针，则需将钨丝置于本生灯火焰上加热1-1.5分钟，烧去金属部分，形成极细的尖端。通过显微镜检查尖端质量。建议在移植前立即用火焰对两根针进行数秒的灭菌处理。

第3部分：试剂的准备

  1. 无钙斑马鱼林格液（ZFR）溶液（116 mM NaCl，2.9 mM KCl，5 mM HEPES，pH 7.2）
  2. 无钙斑马鱼林格氏溶液（含0.2% EDTA，pH 7.2）
  3. 无钙ZFR中的1.2%琼脂糖（低熔点）
  4. 无钙ZFR中的0.2%琼脂糖（低熔点）
  5. 胚胎培养基（pH 7.0，每升含：10 ml Hanks 溶液#1，1 ml Hanks 溶液#2，10 ml Hanks 溶液#4，10 ml Hanks 溶液#5，0.35 g 碳酸氢钠，300 uL 2M HCl，青霉素-链霉素 500,000U）如 斑马鱼手册 （俄勒冈大学出版社，2000）
  6. 钨丝，镀金，直径0.1 mm，Alfa Aesar
  7. 毛细管，1.0 mm 直径，World Precision Instruments

第4部分：移植手术

  1. 在塑料离心管中，将1.2%低熔点琼脂糖加入无钙ZFR中，于水浴中预热至40°C。
  2. 在所需发育阶段（例如30 hpf），用巴斯德移液管吸取胚胎，缓慢将其排入离心管中，并在离心管中孵育约5秒。供体和受体应分别孵育。
  3. 用移液管从离心管中吸取含有胚胎的1.2%琼脂糖，将其排列在100 mm聚苯乙烯培养皿中的两排平行线上，保持供体与受体分开。通过缓慢而小心地吹出液体，大多数胚胎将在琼脂糖中侧卧。在琼脂糖凝固前，需使用钝头针重新调整未处于此位置的胚胎，使其眼睛朝上。
  4. 等待1.2%琼脂糖完全凝固后，再在其上覆盖一层0.2%低熔点琼脂糖溶液。
  5. 使用锋利的针头去除眼睛周围的琼脂糖，并用小幅度动作小心地将供体和受体胚胎的晶状体切出。切割时应紧贴晶状体边缘，避免撕裂，同时避免去除过多宿主眼部其他组织。
  6. 一旦游离，晶状体会漂浮在培养基中。使用钝头针将供体晶状体小心推至宿主晶状体正常位置的上方，然后用钝头针将其压入眼内。宿主原有的晶状体可弃去。
  7. 将供体和宿主胚胎保留在1.2%琼脂糖中30–60分钟，然后用锋利针头将其从琼脂糖中释放，并转移至含胚胎培养基的24孔板中。每个胚胎应置于单独的孔中。务必正确标记各孔，以明确对应关系，即每个宿主对应哪个供体。
  8. 在28.5°C下孵育。可根据GFP荧光区分来自供体的晶状体与同一动物未手术侧的宿主晶状体。也可制备切片以测量晶状体大小，并判断其是否正常分化。

玻璃毛细管示意图、色谱装置，标注点 A、B、C，说明过程。
图 1 用于晶状体移植的修尖针头的低倍显微图像。将一根玻璃毛细管（B）插入巴斯德移液管（A）中，再将一根细钨丝（C）插入毛细管的开口端。用本生灯加热使覆盖在钨丝上的玻璃软化。用镊子夹住带金属丝的玻璃端保持稳定，同时用手扭转巴斯德移液管的另一端。软化的玻璃应螺旋缠绕在金属丝上，将其牢固固定。


用于光激发和发射研究的光纤探针尖端的显微镜图像。
图2 用于晶状体移植的两种类型针头的尖端。


在可见光和紫外光下眼球移植荧光比较；实验结果分析。
图 3 胚胎在30 hpf时进行晶状体移植。图中显示了供体胚胎（A，B）、携带移植晶状体的受体眼（C，D）以及受体胚胎的对照侧（E，F）。每个眼睛均按所示分别在透射光和紫外光照下成像。照片拍摄于48 hpf。本实验使用了Q01[9]转基因品系。

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讨论

在晶状体移植过程中，有几个步骤需要特别注意。

  1. 锐化针头：在进行晶状体移植前，最好预先准备多根针头，且针尖应尽可能细。较粗的针头因直径较大，会撕裂更多组织，导致眼部无法正常愈合。
  2. 摆放胚胎：移植前需将胚胎调整至侧卧位置。在摆放过程中，1.2%琼脂糖会迅速凝固。为延缓琼脂糖凝固，可将培养皿置于40°C水浴中预热，使其漂浮其中。
  3. 在将供体晶状体植入宿主眼内之前，应尽量清除宿主头部周围的琼脂糖，以便更顺利地插入供体晶状体。
  4. 晶状体移植后，应立即将胚胎保留在1.2%琼脂糖层中，并在其上方覆盖一层0.2%琼脂糖。 加入含抗生素的胚胎培养基可促进供体与宿主胚胎的伤口愈合。 待30–60分钟后，再将胚胎从琼脂糖中释放，并转移至含有胚胎培养基的24孔板中。

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致谢

该实验流程在很大程度上遵循了比尔·杰弗里（Bill Jeffrey）实验室为洞穴鱼开发的移植技术。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 mm 直径的钨丝A Johnson Matthey45086
低熔点琼脂糖Sigma-Aldrich39346
硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instruments, Inc.TW 100-4
镊子Dumont11252-30
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20C
移液器泵Fisher Scientific13-683C
培养皿Cardinal HealthD1906
青霉素-链霉素GIBCO, by Life Technologies15140-122

参考文献

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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GFP

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