在立体定位空间中解剖非人灵长类动物大脑

摘要

非人灵长类动物是我们理解大脑正常功能的重要转化研究物种。灵长类动物大脑的解剖结构可为人类正常及病理状态提供重要的研究依据。

摘要

使用非人灵长类动物为我们理解人类的发育和衰老过程提供了一个极好的转化模型^1-6此外，近年来利用非人灵长类动物为自然模拟酒精滥用等复杂的精神疾病提供了机会⁷. 本文介绍一种在绿猴冠状面上进行脑组织切片的技术（Chlorocebus aethiops sabeus) 在立体定位空间中的完整颅骨内。此处描述的方法可在不同组织块和不同受试者之间提供标准的切片平面，并最大限度地减少组织块之间的部分切片。以冠状面切片方式切割组织块还有助于清晰界定感兴趣区域。由于采用该方法所获得的组织块尺寸适中，例如，仅一只绿猴的单侧大脑半球在50μm厚度切片时即可产生超过1200张切片。此外，将脑组织分割为1cm大小的组织块，有利于蔗糖充分渗透以实现冷冻保护，并使组织块能够在标准冷冻切片机上进行切片。

方案

第1部分：组织的预处理

1. 组织应使用多聚甲醛、戊二醛或福尔马林充分灌注。可通过常用于获取其他器官的标准经心脏灌注法实现。在本研究中，受试对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。随后用PBS配制的4%多聚甲醛溶液灌注5分钟（约1升）。

第二部分：立体定位切块

1. 在将头部放入立体定位仪框架之前，需先确定霍斯利-克拉克/耳间平面的零点坐标。该平面为两耳之间的理论中点。测量此平面时，需将耳杆在装置中对称安装，然后将手术刀片固定于立体定位操纵臂上，测量两耳杆之间的中点位置。此步骤对于根据研究需求确定组织切块位置至关重要。完成测量后，需对颅骨进行处理，以便将其固定于立体定位装置中。
2. 为将头部放入立体定位仪框架，需使用骨剪和手术刀去除下颌骨。同时，需去除皮肤、肌肉和结缔组织，以充分暴露颅骨。在去除颅骨上的结缔组织后，通过凿除颅顶骨（包括枕骨的板状部分以及顶骨和额骨）来暴露脑组织。在本实验中，部分颅顶骨已预先去除。操作时需注意避免完全去除颞骨，因为耳道必须保持完整，以便将头部固定于立体定位仪框架中。随后应清除暴露脑组织表面残留的硬脑膜。此时颅骨已准备就绪，可进行立体定位仪固定。
3. 按照立体定位手术的标准操作方式，调节眼眶、腭部和耳杆，确保头部在立体定位装置中牢固固定....

讨论

圣基茨绿猴（Chlorocebus aethiops sabeus）是一种旧大陆灵长类动物，其大脑皮层和皮层下结构的发育模式与速率与人类相似。该物种已被用于模拟多种复杂的人类行为障碍，如焦虑行为、高血压⁸、半球切除术⁹、帕金森病¹⁰、阿尔茨海默病¹¹以及酒精滥用¹²。最近，该物种还被用于研究自然状态下产前乙醇暴露对神经解剖结构的影响。在妊娠晚期，允许怀孕的绿猴每周四次饮用相当于3至5个标准饮酒单位的酒精，我们发现其额叶皮层的神经元数量减少了35%¹³。本研究中，脑组织通过立体定位法进行取材，仅需对7个脑块中的3个进行切片，即可完成对额叶皮层的体视学评估。这种技术不仅限于非人灵长类动物的大脑，也可推广应用于啮齿类动物的大脑。例如，若研究关注的是大鼠的体感皮层，则可使用啮齿类动物立体定位仪，在该区域的前后位置进行立体定位切割。这样可限定切片范围，并确保不同动物之间具有标准的冠状切面。需要注意的是，在使用立体定位操作仪进行任何内侧-外侧移动之前，必须先将刀片完全从脑组织中撤回，否则刀片将不必要地.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
手术刀片	Fine Science Tools	10011-00
剪刀	Fine Science Tools	14090-11	任何外科剪刀均可满足要求
咬骨钳	Fine Science Tools	16121-14
镊子	Fine Science Tools	11027-12
滤纸	Fisher Scientific	09-924-150
立体定位仪	Kopf Instruments
组织切片刀	Thomas Scientific