脑库建设及生物样本的系统性取样为无偏倚的体视学分析奠定了基础，并最大限度地提高了从每个标本中获取的数据量。
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本文内容
摘要
摘要
无偏倚体视学是一种能够准确且高效地估算特定感兴趣区域内神经元总数（或其他细胞类型）的方法。1为了实现这一目标，应系统性地取材6-10个切片区域，覆盖整个结构。通常这涉及处理1/5系列切片，从而会遗留大量未处理的组织材料。为了最大化利用组织资源，我们提出一种经济有效的方法，将固定组织作为长期储存研究计划的一部分进行保存。在对组织进行切片并处理用于所需染色或抗体检测时，应系统地将备用切片置于抗原保护液中，并于-20°C保存以备后续使用。通过使用24孔板，可将切片按顺序存放，便于日后取用。采用该方法，组织可在数年内保持稳定，并适用于后续的免疫组织化学处理。
方案
第1部分：组织的预处理
- 组织应使用多聚甲醛、戊二醛或福尔马林充分灌注固定。可通过标准的经心脏灌注方法实现，该方法通常用于其他器官的取材。在本研究中，受试对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度麻醉，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）直至完全放血。接着用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注约5分钟（约1升）。
- 应根据立体定位仪坐标对脑组织进行切块，从颅骨中取出后称重并测定体积2。随后将组织置于梯度浓度的蔗糖溶液中进行冷冻保护，最终在磷酸盐缓冲液中达到30%蔗糖浓度。组织块随后置于异戊烷中于-65°C下冷冻，并储存在-80°C直至准备切片。
第二部分：系统抽样
- 系统性取样在切片前需要制定合理的计划。应明确定义感兴趣区域在前后方向和背腹方向的完整范围。使用该物种的立体定位图谱有助于界定感兴趣区域，并确定感兴趣区域的长度。一旦确定了感兴趣区域的长度，就需要建立取样间隔。例如，根据立体定位图谱，您确定在冠状面切片时，感兴趣区域的整个前后范围长度约为 3 mm。然后您决定将冷冻切片机设置为 50 μm 进行切片，在此条件下，将获得 60 张切片以覆盖感兴趣区域的整个前后范围。对于典型的无偏倚体视学研究，需要 6–10 张系统取样的切片才能获得可靠的结果。在此示例中，沿前后方向均匀分布的 10 张切片将产生 1/6 的取样间隔。
第3部分：脑库的建立
- 确定切片采样频率后，下一步是确定需要立即进行的染色类型。例如，如果使用焦油紫（cresyl violet）染色，则每6张切片中取1张置于载玻片上，此为第1系列。如果存在多种潜在抗体需要检测，但希望先观察主染色结果，或暂时无时间进行免疫组织化学实验，则将剩余的5个系列切片按切片顺序放入含有抗原保护液（1% 聚乙烯吡咯烷酮，50% 乙二醇溶于0.1 M PBS，pH 7.4）的孔中保存。下表提供了一种采样方案，包含1张载玻片和1块标准48孔板的切片，作为脑库的一部分（表1）。
表1. 此处切片采样频率为1/6。第1张切片置于载玻片上用于焦油紫染色，随后5张切片放入抗原保护液中。第7张切片再次置于载玻片上，而第9至12张切片则放入抗原保护液中。此循环持续进行，直至目标区域或组织块被完全切片。 - 下一步是对组织块进行完全切片。在样品头（chuck）上涂抹少量包埋介质并使其冻结。将样品头装入切片机头部，修片至获得平整表面。将样品头从切片机头部取下，平放于冷冻切片机（cryostat）内。在样品头上倒入包埋介质，并将脑组织块牢固地放置其上，确保立体定位切割面平整贴合样品头。缓慢而完全地用包埋介质包裹脑组织。将带有脑组织的样品头装回切片机头部，并按照预先确定的切片采样频率参数进行切片。
- 当组织块完全切片完毕且切片已放入各孔后，用盖子盖好板，再用封口膜包裹盖子，置于-20°C冰箱中保存。记录每个系列的总切片数、切片采样间隔以及每只动物的系列数量。该记录对于后续从脑库中取出切片进行免疫组织化学实验至关重要。
第4部分：代表性结果：
在过去3年中，以这种方式进行系统性取样一直是本实验室的标准操作。我们将切片后保存在抗原保护液中的组织用于免疫组织化学分析，即使经过3年储存，信号仍未出现衰减，取得了大量成功（图1）。此外，作为我们脑库的一部分，已为长期研究计划存档了近20,000张非人灵长类动物脑组织的系统性切片（图2）。
图1. 该切片来自非人灵长类动物枕极，经NeuN免疫染色，显示第VI层及白质中间神经元。此特定切片在-20°C抗原保护液中保存了2年。比例尺 = 100µm。
图2. 我们的绿猴脑库目前包含来自30多只猴子的近20,000张系统性切片。
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讨论
系统性取样是一种旨在最大化利用研究材料的低成本方法。该取样策略设计用于符合无偏立体学的要求，即在整个区域内进行系统性取样。保持每个系列切片的顺序至关重要。在我们的实验室中，此方法已成功用于储存仓鼠和非人灵长类动物的脑切片。迄今为止，我们已收集了近20,000张绿猴（Chlorocebus aethiops sabeus）的脑切片，并 routinely 对储存超过一年的切片进行免疫组织化学染色。一个特征明确的脑库的优势包括：能够在不同资助周期之间持续收集数据、使新学生能够快速获取数据，以及减少对新动物的使用和处理，从而最大化科研资金的使用效率。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Ikiel Ptito 提供的持续技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙二醇 | Fisher Scientific | E178-4 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific 包埋介质 | Fisher Scientific |
参考文献
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
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重印与许可
