非人灵长类动物在我们理解发育和衰老过程中是一个重要的转化研究物种。灵长类动物视网膜的解剖结构可能为人类正常及病理状态提供重要见解。
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本文内容
摘要
摘要
人类的视觉系统被认为是通往世界的主要门户，在众多感觉、知觉和认知过程中起着核心作用。因此，视觉质量与生活质量密切相关也就不足为奇了。尽管目前针对视觉障碍病因的临床和基础研究已十分广泛，但许多形式的视力损伤，如视网膜色素变性与黄斑变性，仍然缺乏有效的治疗方法。非人灵长类动物的眼睛发育特征与人类最为接近。它们不仅具有相似的血管解剖结构，而且在所有哺乳动物中，灵长类动物在视网膜颞侧拥有一块专司高视觉敏锐度的特殊区域——中央凹，这一特征是其独有的。1. 本文介绍一种用于解剖灵长类动物视网膜的通用技术，以获取适用于视网膜组织学、免疫组织化学、激光捕获显微切割，以及光镜和电镜检查的组织样本。随着非人灵长类动物作为转化研究模型的广泛应用，我们期望对视网膜的深入理解能够为减轻或逆转视觉障碍对患者生活质量所造成的负面影响提供有效策略的科学依据。
方案
第1部分：组织的预处理
- 组织应使用多聚甲醛、戊二醛或福尔马林充分灌注固定。可通过标准的经心脏灌注法实现，该方法通常用于其他器官的取材。建议在动物处死后立即在晶状体下方注射固定液，并将眼球保存在固定液中。
- 本研究中，受试对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）直至完全放血。随后用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注5分钟（约1升）。
第二部分：从眼眶中取出眼球
- 为了更方便地接触眼球，建议先移除脑组织。脑组织移除后，薄壁的眶骨即清晰可见。使用咬骨钳缓慢凿除眶壁。用解剖刀切断眼外肌，并去除眼球周围的结缔组织。小心切断视神经，该神经可用于电子显微镜研究。此时眼球应已从眼眶中完全游离。
第3部分：从眼杯中分离视网膜
- 将眼球置于含有 PBS 的培养皿中，以防止视网膜干燥。解剖显微镜或台式放大照明支架有助于解剖操作，但并非必需。使用弹簧剪刀在锯齿缘水平紧贴角膜周缘剪开巩膜，随后用镊子取出晶状体。
- 使用画笔、镊子和弹簧剪刀将视网膜从巩膜上分离。操作时先将视网膜与巩膜分离，再用剪刀剪除巩膜。此过程需分小步进行，以免损伤或撕裂视网膜组织。由于巩膜与残留的视神经不易分离，应小心地在视神经周围剪开巩膜。
- 此时视网膜仍保持其曲面形态，需展平以便取样。在展平前，可将质地如凝胶状的玻璃体整体移除。为将视网膜展平于载玻片上，需用手术刀片做数条放射状切口。随后可用普通滤纸和画笔去除残留的玻璃体。此时视网膜神经节细胞层已暴露，因此在清除玻璃体时务必轻柔操作。若视神经仍附着于视盘处，应使用手术刀片和弹簧剪刀在不撕裂视网膜的前提下将其移除。此时即获得一张平铺的视网膜标本（图1），黄斑区应表现为视盘颞侧/腹侧方向的一块深色区域。
第4部分：取样
- 视网膜取样有多种方法可供选择。本文将介绍视网膜平铺制备法及等距取样法。两种方法均需将视网膜平铺于载玻片上，且节细胞纤维层朝下。若需在平铺制备中观察视网膜节细胞层，则必须去除或漂白色素上皮层。去除色素上皮层时，可用画笔轻轻刮除部分该层组织，但此操作易损伤光感受器层。漂白法是将视网膜浸泡于高锰酸钾溶液（0.25%）中1小时，随后用蒸馏水冲洗，并在草酸（5%）中透明处理5分钟2。
- 若需在整个视网膜范围内研究各层细胞的分布与形态，则建议采用等距取样法。应将视网膜平铺于载玻片上，并用PBS保持湿润。进行等距取样时，从视盘向鼻侧、颞侧、上方和下方等距离处切取小块组织（图1）。此制备过程中无需漂白色素上皮层。这些组织块可根据研究需求，使用冷冻切片机、振动切片机或超薄切片机在冠状面进行切片。若采用冷冻切片，应将组织块在30%蔗糖溶液中4℃过夜进行冷冻保护，随后在干冰条件下以封片介质包埋并速冻。或者，也可将样品包埋于琼脂中，使用振动切片机进行切片。冷冻切片与振动切片通常可稳定获得厚度为4 µm的切片。若需要更薄的切片（例如用于电镜制样），则需制备超薄切片。为此，切片应在通风橱中用四氧化锇后固定1小时，随后经梯度乙醇系列（50%、70%、95%、95%、100%、100%）及100%丙烯酸氧化物进行脱水处理，最后将组织包埋于Epon树脂（EMBed-812包埋试剂盒）中。
第5部分：代表性结果：
在我们的实验室中，我们常规对冷冻切片的视网膜进行免疫组织化学染色（图2）。本例中，我们关注的是灵长类动物视网膜中大麻素受体（CB1）的等密度分布。我们还研究产前乙醇暴露对灵长类视觉系统的影响。为此，我们关注中央凹及周边视网膜的细胞密度和层次厚度。为实现这一目标，我们将视网膜组织块包埋于Epon树脂中，使用超薄切片机切取700 nm厚的切片，并用1%甲苯胺蓝染色（图3）。
图1 视网膜平铺制片。 通过放射状切口将视网膜展平。
图2 免疫染色。 周边视网膜的冷冻切片经CB1免疫染色，其中视网膜神经节细胞层显著着色，内核层和外核层也有部分着色。该切片厚度为14 µm，在载玻片上进行染色。RG - 视网膜神经节细胞层；IP - 内丛状层；IN - 内核层；OP - 外丛状层；ON - 外核层。
图3 黄斑中心凹。 经Epon包埋并在超薄切片机上以700 nm厚度切取的黄斑中心凹横切面。利用光感受器层（PR）对切片进行对齐。可见光感受器层的完整范围均能被识别，表明切片在冠状面上的角度适当。使用Bioquant成像系统在距黄斑凹中心300 µm、500 µm和800 µm处进行密度测量。
RG — 视网膜神经节细胞层；IP — 内丛状层；IN — 内核层；OP — 外丛状层；ON — 外核层；比例尺 = 50 µm
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讨论
将视网膜制备成整体装片，可对视网膜神经节细胞层或视网膜血管内皮细胞的拓扑结构和空间分布进行分析3。在灵长类动物视网膜周边区域，细胞密度的定量分析易于实现。然而，在近中央凹和中央凹区域，由于神经节细胞层中多层细胞堆叠，阻碍了准确的定量分析。为避免这一潜在偏差，可从整体装片中分离出中央凹及近中央凹区域，将其包埋于Epon树脂中，并使用超薄切片机进行连续切片，获得冠状面的半薄切片2,4。整体装片制备方法还存在其他若干缺点，这些缺点可通过替代的取样范式加以克服。
从视网膜获取等距样本，并在恒冷切片机或振动切片机上进行冠状面切片，可实现对不同视网膜层的特异性观察，而这种观察在整体视网膜标本上难以完成。以这种方式切片还允许应用多种免疫组织化学方案5。这些切片随后可从载玻片上取下，包埋于Epon树脂中，并在超薄切片机上进行切片。使用超薄切片机可微调切片角度，以确保穿过光感受器细胞的切面保持标准的冠状面。一旦获得标准切面，即可测量并比较不同视网膜区域及不同个体间的各层厚度。此外，Epon包埋的组织可用于电子显微镜研究，以揭示视网膜...
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致谢
作者谨此感谢 Ikiel Ptito 提供的技术支持。我们衷心感谢 Frank Ervin、Roberta Palmour 以及位于西印度群岛圣基茨的行为科学基金会实验室的工作人员，他们持续支持我们的灵长类动物研究工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术刀 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 手术刀片 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 14090-11 | 任何外科剪刀均可满足要求 |
| 咬骨钳 | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| 滤纸 | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| 骆驼毛或貂毛画笔 | 任意供应商 |
参考文献
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
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