通往大脑之门：灵长类眼球的解剖

摘要

非人灵长类动物在我们理解发育和衰老过程中是一个重要的转化研究物种。灵长类动物视网膜的解剖结构可能为人类正常及病理状态提供重要见解。

摘要

人类的视觉系统被认为是通往世界的主要门户，在众多感觉、知觉和认知过程中起着核心作用。因此，视觉质量与生活质量密切相关也就不足为奇了。尽管目前针对视觉障碍病因的临床和基础研究已十分广泛，但许多形式的视力损伤，如视网膜色素变性与黄斑变性，仍然缺乏有效的治疗方法。非人灵长类动物的眼睛发育特征与人类最为接近。它们不仅具有相似的血管解剖结构，而且在所有哺乳动物中，灵长类动物在视网膜颞侧拥有一块专司高视觉敏锐度的特殊区域——中央凹，这一特征是其独有的。¹. 本文介绍一种用于解剖灵长类动物视网膜的通用技术，以获取适用于视网膜组织学、免疫组织化学、激光捕获显微切割，以及光镜和电镜检查的组织样本。随着非人灵长类动物作为转化研究模型的广泛应用，我们期望对视网膜的深入理解能够为减轻或逆转视觉障碍对患者生活质量所造成的负面影响提供有效策略的科学依据。

方案

第1部分：组织的预处理

1. 组织应使用多聚甲醛、戊二醛或福尔马林充分灌注固定。可通过标准的经心脏灌注法实现，该方法通常用于其他器官的取材。建议在动物处死后立即在晶状体下方注射固定液，并将眼球保存在固定液中。
2. 本研究中，受试对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）直至完全放血。随后用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注5分钟（约1升）。

第二部分：从眼眶中取出眼球

1. 为了更方便地接触眼球，建议先移除脑组织。脑组织移除后，薄壁的眶骨即清晰可见。使用咬骨钳缓慢凿除眶壁。用解剖刀切断眼外肌，并去除眼球周围的结缔组织。小心切断视神经，该神经可用于电子显微镜研究。此时眼球应已从眼眶中完全游离。

第3部分：从眼杯中分离视网膜

1. 将眼球置于含有 PBS 的培养皿中，以防止视网膜干燥。解剖显微镜或台式放大照明支架有助于解剖操作，但并非必需。使用弹簧剪刀在锯齿缘水平紧贴角膜周缘剪开巩膜，随后用镊子取出晶状体。
2. 使用画笔、镊子和弹簧剪刀将视网膜从巩膜上分离。操作时先将视网膜与巩膜分离，再用剪刀剪除巩膜。此过程需分小步进行，以免损伤或撕裂视网膜组织。由于巩膜与残留的视神经不易分离，应小心地在视神经....

讨论

将视网膜制备成整体装片，可对视网膜神经节细胞层或视网膜血管内皮细胞的拓扑结构和空间分布进行分析³。在灵长类动物视网膜周边区域，细胞密度的定量分析易于实现。然而，在近中央凹和中央凹区域，由于神经节细胞层中多层细胞堆叠，阻碍了准确的定量分析。为避免这一潜在偏差，可从整体装片中分离出中央凹及近中央凹区域，将其包埋于Epon树脂中，并使用超薄切片机进行连续切片，获得冠状面的半薄切片^2,4。整体装片制备方法还存在其他若干缺点，这些缺点可通过替代的取样范式加以克服。

从视网膜获取等距样本，并在恒冷切片机或振动切片机上进行冠状面切片，可实现对不同视网膜层的特异性观察，而这种观察在整体视网膜标本上难以完成。以这种方式切片还允许应用多种免疫组织化学方案⁵。这些切片随后可从载玻片上取下，包埋于Epon树脂中，并在超薄切片机上进行切片。使用超薄切片机可微调切片角度，以确保穿过光感受器细胞的切面保持标准的冠状面。一旦获得标准切面，即可测量并比较不同视网膜区域及不同个体间的各层厚度。此外，Epon包埋的组织可用于电子显微镜研究，以揭示视网膜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
手术刀片	Fine Science Tools	10011-00
弹簧剪	Fine Science Tools	15020-15
剪刀	Fine Science Tools	14090-11	任何外科剪刀均可满足要求
咬骨钳	Fine Science Tools	16121-14
镊子	Fine Science Tools	11027-12
滤纸	Fisher Scientific	09-924-150
骆驼毛或貂毛画笔	任意供应商