了解何为关键：非人灵长类动物大脑中的无偏立体学

摘要

灵长类动物大脑的解剖结构可为人类正常及病理状态提供重要见解。无偏倚体视学是一种能够准确、高效地估算特定参考空间内神经元总数（或其他细胞类型）的方法¹。

摘要

非人灵长类动物是理解人类大脑正常功能及疾病过程的重要转化研究物种。体视学无偏采样法是目前公认的组织切片中生物结构定量分析的金标准方法。²，可为哺乳动物大脑中的生物学特征生成可靠的结构数据³. 该方法的关键要素包括对解剖学定义的结构（参考空间）进行无偏倚（系统-随机）采样，并对参考空间内生物物体的细胞数量与大小、纤维和毛细血管长度、表面积、区域体积及其空间分布进行定量分析⁴. 与以往方法相比，这些体视学方法的优势在于避免了因错误假设和无法验证的模型所导致的所有已知系统性（非随机）误差来源。本研究记录了计算机化体视学在生物学中的一项应用，用于估算非洲绿猴脑额叶皮层中的神经元总数（Chlorocebus aethiops sabeus)，并在两个商用体视学软件 BioQuant Life Sciences 和 Stereologer 的辅助下完成（图1）。除了对 BioQuant 和 Stereologer 所得结果进行对比分析外，Stereologer系统，本研究提供了一个详细的方案Stereologersystem

方案

第1部分：组织预处理应按照Burke等（2009）的方法进行⁵。

1. 简而言之，组织应充分灌注多聚甲醛、戊二醛或福尔马林。可通过标准的经心脏灌注方法实现，该方法通常用于其他器官的取材。在本研究中，实验对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。接着用PBS配制的4%多聚甲醛溶液灌注约5分钟（约1升）。组织应充分固定于多聚甲醛、戊二醛或福尔马林中。脑组织应按照立体定位仪坐标进行切割修块，从颅骨中取出，称重，测定体积，进行冷冻保护处理，然后冷冻保存⁵。

第2部分：根据Burke等人（2009）的方法对组织进行系统性取样⁶。

1. 在本示例中，我们重点关注了绿猴大脑的额叶。参考空间定义为包含左半球从中央沟至额极的皮层组织。根据我们的研究目的，皮层切片按1/10系列进行取样，切片厚度为50µm。其中一个完整系列用焦油紫染色（系列#1）。系列2被分为两部分，其中一半切片用氯化金染色以显示髓鞘，另一半切片则进行乙酰胆碱酯酶染色（用于界定某些皮层下区域）。其余所有系列切片均以抗原保护液保存，作为我们长期研究计划的一部分。

第3部分：体视学（更多细节参见 Mouton 2002）⁴

1. 细胞总数（N）的估算基于以下公式计算：
   N = ssf-1 × asf-1 × tsf-1 × ΣQ-
   其中，ssf 为切片采样分数，asf 为面积采样分数，tsf 为厚度采样分数（即组织实测厚度除以体视学分隔器高度），∑Q- 为在分隔器内计数到的目标对象总数。本方案后续部分将说明如何确定 ssf、asf、tsf 和 ∑Q。
   
2. 切片采样分数（非计算机辅助）
   1. 必须明确定义从前到后、从背侧到腹侧的整个参考空间。在本示例中，我们关注的是额叶，将其定义为从前端额极尖（前）至中央沟（后）以及外侧沟（腹侧）之间的区域，并排除脑岛。
   2. 对于该特定受试者的额叶，共系统性地收集了760个切片，其中76个经焦油紫（cresyl violet）染色。由于目标是在整个参考空间内采集约10个切片，因此对焦油紫染色切片按1/6的比例进行采样，得到切片采样分数约为1/60。我们从最初的6个焦油紫染色切片中随机选择一个作为起始点，之后系统性地每隔6个切片采样一次。该受试者共采样了13个切片（图2）。
3. 
   面积采样分数（计算机辅助）
   
   1. 预实验将确定最佳网格大小，即面积采样分数，以在参考空间内采样约100–300个体视学分隔器。在该受试者的额叶中，采用2500 µm²的网格大小，平均产生254个分隔器（图2）。每个分隔器内计数的对象数量应控制在约0–5个之间，本例中为神经元。
4. 厚度采样分数（计算机辅助）
   1. 在每个分隔器位置，测量组织的高度，并对该高度的一部分进行采样，此即厚度采样分数。为确定实测厚度，需沿z轴方向调焦，直至第一个细胞清晰聚焦，然后略微回退至切片顶部，即继续上移至最后一个物体刚好失焦的位置。为确定组织底部，继续沿z轴调焦，直至细胞刚好模糊不清。
   2. 在z轴调焦过程中，各深度均应观察到染色细胞；若未观察到，则可能提示染色剂渗透不完全或组织脱水不均，此时应重新染色。此注意事项对于需要免疫探针穿透相对较厚组织切片的免疫染色组织尤为重要。因此，免疫染色组织应使用嗜碱性染料（如焦油紫、苏木精）进行轻度复染，以准确判断切片的顶部和底部，并确认抗体的渗透情况。本研究中，切片在切片机上设定为50 µm厚度。完成全部组织处理后，实测组织厚度平均为17.9 µm（图2），平均收缩率约为65%。需注意，这些结果代表了常规组织学制备处理后组织的典型收缩水平⁷。
   3. 典型研究中分隔器的默认高度为10 µm。分隔器高度与实测切片厚度之间的差值称为“保护高度”（guard height），该部分组织体积内不进行生物学特征的计数。使用保护高度可避免切片表面的组织损伤（如丢失帽状结构）。
5. 计数对象的总数，ΣQ-
   1. 为避免因识别错误带来的偏差，必须遵循针对特定生物学特征的标准定义。本例中，我们关注神经元的计数。因此，神经元被定义为具有可见的中央核仁和清晰可辨的细胞质，而胶质细胞通常缺乏可见的核仁和细胞质。该受试者共计数到457个神经元。

第4部分：Stereologer —— 一种计算机化的体视学系统（Stereology Resource Center，马里兰州切斯特）

1. Stereologer 系统会以逐步引导的方式提示用户填写必要的信息。在“研究信息”部分中设定研究参数。由于必须为研究定义一个参考空间，因此应选择体积参数（对于参考空间，应选择 Cavalieri 估计法）。此处也可选择目标对象群体的数加权体积（object volume）以进行估算。在本示例中，仅选择了参考空间的体积。针对每个对象，需选择其数量并定义感兴趣特征，在本例中为神经元（Neurons）。
2. 案例初始化：在此部分设定采样信息。输入切片采样间隔（如果组织被完整地切成多个切块，且每张切片按顺序放置，则此处输入 1）。输入穿过参考空间的总切片数（本例中为 760）。然后输入切片采样间隔（本例中为 59）。系统将自动计算出需要采样的切片数量（本例中为 13）。
3. 探针参数：此部分定义网格和体视学探针（disector）的大小。对于体积测量，使用低倍镜（2.5x–10x）在编辑菜单下设定网格间距。对象观测应在 100x（数值孔径 N.A. 1.3 或 1.4）下进行。框架面积即为体视学探针的大小，本例中使用 50% 屏幕大小。框架高度为体视学探针的厚度，此处设为 10µm。框架间距即为网格的大小。在我们的预实验中发现，采用 2500µm 的间距可在相对较大的参考空间内系统均匀地分布约 150–200 个框架。对于较小区域，应使用更小的网格尺寸。预实验将确定每个具体研究的光学探针参数。
4. 一旦研究参数设定完成，即可开始对组织进行采样。程序将提示您开始采样第一张切片。步骤 1： 程序将在低倍镜下提示用户勾画该切片上的参考空间。系统将根据探针参数在切片上叠加一个网格，随后用户需确认各点是否位于参考空间内。若某点不在参考空间内，只需点击该点，系统将不将其计入体积计算。步骤 2： 系统将根据框架间距参数在参考空间上叠加一个新的网格，用户需验证交点是否落在参考空间内。步骤 3： 系统将提示用户切换至高倍物镜，并移动载物台至第一个体视学探针位置。步骤 4： 此时系统将提示用户定义切片的顶部和底部，随后系统将在 z 轴方向设定采样空间。步骤 5： 用户需点击在 z 平面内位于体视学探针范围内的每一个对象。接触红色边线或体视学探针底部的对象不得计数。每计数完一个对象后，点击“下一个”。载物台将移至下一个体视学探针位置，并重复步骤 4 和 5。当该切片的所有体视学探针均完成计数后，系统将提示用户插入下一张连续切片进行探测。重复步骤 1–5，直至所有连续切片均完成采样。系统将随后提供 asf、ssf、tsf 和 ∑Q 的计算结果。基于这些参数，系统将生成估计的 N 值、参考体积以及估计数量和体积的变异系数（CE）。系统还将给出提高效率或降低 CE 的建议（图 2）。

第5部分：代表性结果：

无偏倚体视学可对参考空间内的细胞群体提供高效且可靠的估算。目前已有多种基于计算机的体视学系统，这些系统均依赖于系统性取样和明确定义的参考空间。我们曾使用 BioQuant Life Sciences 系统估算2岁绿猴大脑皮层的总神经元数量超过8.28亿（图3），平均变异系数（CE）为0.042。随后，我们又使用 Stereologer 系统估算发现，额叶约占皮层神经元总数的一半⁸。

图1 基于计算机的体视学系统。 体视学系统的基本配置相同，包括配备电动载物台（x-y-z方向）、载物台控制器、视频摄像头、计算机和软件的显微镜。最终选择的系统应基于效率、实际需求和成本分析。

研究信息
研究名称	额叶皮层
主要研究者	MB
物种	AG
参考空间 额叶	皮层
备注
样本信息
数据采集者	MB
日期	2008年4月30日，星期三
组别	对照组
受试者	O26
备注
采样特征
切片采样间隔	1
总切片数	760
切片采样间隔	59
起始切片	2
分数
ASF	0.0002
SlabSF	1.0000
SSF	0.0169
TSF	0.5587

结果摘要
参数	探针	名称	结果	CE	SD
厚度	---	---	17.8996 µ	---	---
数量	Disector	神经元	243833769.1473	0.0474	N/A
体积	Cavalieri Point Grid	体积	1719769397954.1284 µ^3	0.0078	N/A

建议
探针	对象数量（神经元）
CE	0.0474
建议	CE 可接受。

观察的 disector 数量过高，应增加 disector 间距。
探针	区域体积（体积）
CE	0.0078
建议	CE 可接受。

切片结果
切片	神经元 对象数 神经元 角点数	体积 区域点数
1. 40	48	34
2. 26	52	44
3. 29	56	48
4. 39	100	83
5. 49	112	83
6. 53	156	120
7. 65	128	106
8. 45	108	100
9. 52	100	77
10. 26	64	60
11. 21	44	44
12. 11	36	32
13. 1	12	6

使用立体分析系统获得的额叶结果。 对于额叶，立体分析过程中耗时最长的部分是系统采样和切片。每个受试者的拓扑结构、体积和神经元数量估计均在约一天内完成。对左侧半球进行采样，文中将所得数值乘以二，以近似估算双侧半球的总量。

图3 使用BioQuant获得的皮层神经元群体数量估计。 BioQuant系统在进行细胞计数前需要精确的拓扑结构信息。本研究中每例样本平均采集13个切片。每位受试者的皮层拓扑结构构建及后续体积估算耗时15至20小时。拓扑结构构建使用2.5倍物镜完成，细胞计数则采用100倍油浸物镜（数值孔径1.3）进行。在整个左半脑中每隔第100个切片选取一个采样区域，平均每例样本采集约180个体视学采样框（disectors）。完成拓扑结构构建后，神经元计数过程约需一天时间。本研究仅对左半脑进行采样，文中将所得数值乘以2，以估算双侧半脑的总体数量。

讨论

在灵长类动物脑组织中进行无偏倚体视学研究与在其他生物标本中的操作类似。然而，鉴于灵长类脑组织的体积较大，建议制定周密的处理方案，因为一只绿猴的单侧大脑半球在50 µm厚度切片时可产生超过1200个切片。我们首先建议使用立体定位法将脑组织切割为1 cm大小的组织块，这可确保各组织块之间以及不同个体之间的切面标准化，减少组织块之间的部分切片，并使组织块尺寸更易于处理⁵。体视学研究中的一个关键步骤是系统性取样，即在整个参考区域中均匀获取6–10个切片。对于灵长类脑组织而言，这种取样方式会留下大量未处理的组织材料，因此为了最大化每例脑组织所能获取的研究数据，我们建议将组织保存在抗原保护液中，以备长期研究使用⁶。当组织被存档保存后，可针对猴脑中的目标蛋白设计系统性的免疫检测方案，用于后续体视学分析⁹。对于较大的脑区，如大脑皮层或脑叶，可能需要10–14个切片，因此在切片前应预先规划，确保对任何感兴趣的最小参考空间至少获取10个切片。此外，还应在对照个体上开展预实验，以确定体视学研究的各项参数。在展示或解读已发表的体视学数据时，应同时报告asf、tsf

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视学分析软件 Stereologer	体视学资源中心（马里兰州切斯特）	www.disector.com
Stereology Tool-Kit Stereologer 系统	BioQuant生命科学公司（田纳西州纳什维尔）
StereoInvestigator	MBF Bioscience