小鼠乳腺上皮细胞在泌乳分化过程中形成乳腺球

摘要

HC11细胞的泌乳分化可通过形成称为乳腺球的穹顶状结构来表征。可通过相差显微镜对这些结构进行计数，以辅助量化泌乳分化程度。

摘要

一种常用于评估小鼠乳腺上皮细胞培养中泌乳分化程度的表型指标是形成被称为乳腺球体的穹顶状细胞结构¹. HC11 细胞系已被用作研究乳腺泌乳分化调控的模型系统in vitro和体内²HC11细胞在泌乳激素处理下会分化并合成乳蛋白。当HC11小鼠乳腺上皮细胞生长至融合状态后，通过添加包括地塞米松、胰岛素和催乳素在内的泌乳激素组合（简称DIP）诱导其发生泌乳分化。在诱导分化后的不同时间点（最长至120小时）对分化中的HC11细胞进行拍照，并统计每份培养物中出现的乳腺球（mammosphere）数量。单个乳腺球的大小与分化程度相关，这一点在分化细胞的图像中有所体现。

方案

1. HC11 细胞在添加了 10% 胎牛血清、5 μg/ml 胰岛素、10 mM HEPES 和 10 ng/ml 表皮生长因子（EGF）的 RPMI 1640 培养基中培养 6 天至汇合，以建立分化能力。
2. 细胞用 PBS 洗涤，并在不含 EGF 的生长培养基中维持 24 小时。
3. 为诱导泌乳分化，将细胞在分化培养基中孵育，即含有地塞米松（10^-6 M）、胰岛素（5 μg/ml）和催乳素（5 μg/ml）的 RPMI 培养基，简称 DIP。
4. 在添加 DIP 后的指定时间点，使用配备数码相机的 Olympus IX71 显微镜通过相差显微镜观察并拍摄、计数乳腺球。

代表性结果：

图1分别展示了正常乳腺上皮细胞单层培养的低倍镜图像、多个乳腺球的图像，以及单个乳腺球的高倍镜图像。


图1. 乳腺球。 （a）正常乳腺上皮细胞单层应呈现为融合的扁平细胞层。（b）DIP刺激3-5天后出现多个乳腺球。照片拍摄于添加DIP后第5天。（c）添加DIP后第5天，含乳腺球的单个视野的高倍镜图像。

讨论

为了使该技术成功并达到最佳质量，上皮细胞在用泌乳激素诱导前必须维持在汇合状态。有时可能会出现大量乳腺球，使得定量变得困难。因此，为了定量目的，最好在乳腺球数量能够被计数的时间点对其进行拍照。

尽管已有多种分子标志物用于评估乳腺上皮细胞泌乳分化的程度，但对于在二维培养条件下生长的细胞，可用的形态学标志物却很少。上皮细胞单层在培养中能够形成微小的穹顶样结构，使乳蛋白得以聚集，这一特性为观察该发育过程中发生的形态学变化提供了一种有效途径。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	Invitrogen	21870076
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
L-谷氨酰胺	GIBCO, by Life Technologies	25030
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）	GIBCO, by Life Technologies	15140
HEPES 缓冲液	Quality Biological, Inc.	118089060
表皮生长因子（EGF）	Sigma-Aldrich	E9644
胰岛素	GIBCO, by Life Technologies	12585-014
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756
显微镜	Olympus Corporation	IX71
数码相机	QImaging	Retiga 2000RV Fast 1394