从特定组织类型中解离细胞需要优化组织震荡参数，以获得大量具有活性且可培养的细胞。Miltenyi gentleMACS 组织解离器通过一种简单且实用的方案优化了这一操作。本文介绍了该设备在肺组织处理中的应用。
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摘要
摘要
从组织制备单细胞悬液是细胞研究中许多实验的重要前提。解离完整器官的过程需要特定的参数，以可重复的方式获得大量活细胞。gentleMACS解离仪通过简单且实用的方案优化了这一操作。该仪器包含预设程序，专为高效而温和地解离多种组织类型（包括小鼠肺组织）而优化。本文展示了gentleMACS解离仪在小鼠肺组织处理中的应用。
关键词：单细胞悬液，组织解离，细胞研究，gentleMACS解离仪，小鼠肺组织，活细胞
方案
为了在无菌条件下操作，建议在层流罩内完成所有步骤。
1. 材料
- HEPES 缓冲液：10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl2，1.8 mM CaCl2
- 胶原酶 D 溶液：胶原酶 D：100 mg/mL（胶原酶 D > 0.15 U/mg），溶于 HEPES 缓冲液
- DNase I 溶液：20,000 U/mL DNase I
- PBS 缓冲液，pH 7.2
- PEB 缓冲液：1 份 BSA 储存液加入 20 份 autoMACS 洗涤液中
- 组织：来自 6 至 7 周龄成年雌性 BALB/C 小鼠的肺组织，不含邻近器官
- 可选：CD11c 微珠、MACS MS 柱、MACS 分离器，用于从小鼠肺单细胞悬液中分离树突状细胞
2. 解离肺组织
- 用含有 PBS 的培养皿冲洗组织，以去除红细胞。
- 将最多 450 mg 的肺组织转移至含有 4.9 mL HEPES 缓冲液的 gentleMACS C 管中。
- 加入 100 μL Collagenase D 溶液，使 Collagenase D 的终浓度为 2 mg/mL。
- 对于不超过 150 mg 的组织，加入 10 μL DNase I 溶液（DNase I 终浓度为 40 U/mL）；对于 150–450 mg 肺组织，加入 20 μL DNase I 溶液（DNase I 终浓度为 80 U/mL）。
- tightly 封闭 C 管并将其安装到 gentleMACS 组织解离仪上，然后运行程序 "m_lung_01"。
- 在 37°C 下孵育 30 分钟，期间使用自动旋转或每 5 分钟手动翻转一次。
- 将样品重新放回 gentleMACS 组织解离仪，并运行程序 "m_lung_02"。
3. 过滤
- 通过将50 mL离心管的管盖替换为70 μm孔径的细胞滤网，准备用于收集过滤后细胞的离心管。
- 当第二个gentleMACS程序结束后，根据管内样品的分布情况，可短暂离心以使样品沉降至管底。
- 使用合适的1000 μl移液器吸头，通过C管的隔膜密封盖吸取细胞，并将其转移至细胞滤网上。
- 用5 ml室温HEPES缓冲液冲洗细胞滤网。
- 将细胞在50 mL离心管中以300×g离心10分钟，形成细胞沉淀。
- 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于所需体积的PEB缓冲液中。
第4部分：代表性结果：
图 1. 使用 gentleMACS™ 解离仪进行肺组织解离后，获得 92% 的活细胞。死细胞经碘化丙啶（PI）荧光染色（右侧散点图；左侧散点图：无 PI 染色）。
图 2. 使用 gentleMACS 组织解离器解离小鼠肺组织，可获得高比例的活白细胞和内皮细胞。所得单细胞悬液用 CD45-PE 和 CD146-FITC 或 CD31-FITC 染色，并通过流式细胞术进行分析。
图 3. 从小鼠肺组织获得的单细胞悬液用 CD11c-FITC 和 Anti-mPDCA-1-APC 进行染色，以检测小鼠 CD11clow m-PDCA-1+ 浆细胞样树突状细胞以及 CD11chigh 细胞。
图4. 使用CD11c磁珠、MiniMACS分离器和两根MS柱富集树突状细胞。
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讨论
在本视频中，我们介绍了一种新的小鼠肺组织解离方法。我们证明，通过机械和酶解联合处理肺组织，可获得较高比例的活白细胞和内皮细胞。具体而言，组织的机械解离由 gentleMACS 解离器完成。gentleMACS C 管包含一个转子-定子系统，能够以温和的方式解离组织。该过程由仪器的程序设置控制，相关参数已优化，以实现细胞得率和活力的最大化。所获得的单细胞悬液使用 CD45-PE 和 CD146-FITC 或 CD31-FITC 进行染色，并通过流式细胞术检测白细胞和内皮细胞。单细胞悬液中的树突状细胞使用 CD11c-FITC 和 Anti-mPDCA-1-APC 进行染色。此外，利用 MACS 技术从小鼠肺单细胞悬液中富集树突状细胞：使用 CD11c 微珠对树突状细胞进行磁性标记，并通过 MiniMACS 分离器和 MS 柱进行分离1,2。总体而言，我们将新的解离方案与磁性细胞分选技术相结合，建立了一种从肺组织中获取特定细胞类型的标准化方法。
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披露
作者为 Miltenyi Biotec GmbH 的员工，该公司生产本文所用仪器。
致谢
作者为德国 Miltenyi Biotec GmbH 公司的员工。
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材料
参考文献
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
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