从特定组织类型中解离细胞需要优化组织解离的参数，以获得大量具有活性且可培养的细胞。Miltenyi gentleMACS 解离仪通过一种简单且实用的方案优化了这一过程。本文介绍了该设备在神经组织中的应用。
本文内容
摘要
摘要
在神经系统中，已描述了数百种神经元和胶质细胞类型。大脑或脊髓中的每一种特定细胞类型都具有一组独特的细胞表面分子，即分子决定簇，可用于识别和表征该细胞类型。目前，可靠的细胞鉴定与分离技术需要制备单细胞悬液，同时尽量减少细胞死亡并保护特征性表面蛋白的完整性。gentleMACS解离仪与基于胰蛋白酶或木瓜蛋白酶的解离试剂盒联合使用时，能够高效且温和地解离脑组织，同时保护抗原表位并减少细胞损失。通过使用C管和经过优化的预设gentleMACS程序，可实现单细胞悬液的标准化制备。制备完成后，单细胞悬液可进一步使用偶联单克隆抗体（如识别神经前体细胞的Anti-Prominin-1 MicroBeads）进行处理，或利用髓鞘去除磁珠（Myelin Removal Beads）进行纯化。
方案
为了在无菌条件下操作，建议在层流罩内完成所有步骤。
1. 材料
- 神经组织解离试剂盒（P）（组分：溶液1、2、3和4，储存缓冲液）
- 预分离滤器
- （可选）髓鞘去除磁珠
- β-巯基乙醇
- gentleMACS 组织解离仪
- C 管
- MACSmix 试管旋转混合器
- HBSS（无钙镁）
- HBSS（含钙镁）
- 在开始实验方案之前，配制以下溶液：
- 不含二价阳离子 Ca2+ 或 Mg2+ 的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS (w/o)）
- 标准 Hanks 平衡盐溶液，即含有 Ca2+ 和 Mg2+ 的溶液（HBSS (w)）
- 根据后续应用中目标抗原表位的不同，选择使用基于木瓜蛋白酶的神经组织解离试剂盒（P）或基于胰蛋白酶的神经组织解离试剂盒（T）。
- 从神经组织解离试剂盒中配制以下溶液：
- 溶液 2：加入 β-巯基乙醇至终浓度为 0.067 mM
- 溶液 4：将粉末溶解于 0.7 ml 储存缓冲液（试剂盒提供），轻轻混匀（勿涡旋震荡）
- 酶混合液 1：用移液器将 1.9 mL 溶液 2 和 50 μl 溶液 1（均来自试剂盒）加入 C 管中，在 37 °C 孵育 10–15 分钟。此体积足以解离 400 mg 脑组织。
2. 解离神经组织
- 将脑组织放入含有 1 ml HBSS（无钙镁）的离心管中称重
- 将小鼠脑组织转移至 C 管中，加入 1950 μL 预热的酶混合液 1。（注意：本方案适用于 ≤ 400 mg 的组织，但溶液用量可按比例调整，最多可处理每根 C 管 1600 mg 脑组织）
- 将 C 管安装至 gentleMACS 组织解离器，运行程序“m_brain_01”。
- 在 37 °C 条件下，以 4 rpm（使用 MACSmix 管式旋转仪）旋转孵育 15 分钟。
- 将 C 管安装至 gentleMACS 组织解离器，运行程序“m_brain_02”。
- 在解离步骤期间，每 400 mg 组织准备 30 μl 酶混合液 2，通过轻柔混匀 20 μl 溶液 3 和 10 μl 溶液 4 制备。
- 通过隔膜密封盖将酶混合液 2 加入 C 管中，轻轻混匀，避免涡旋。
- 将 C 管置于培养箱中，37 °C 旋转孵育 10 分钟。
- 将 C 管安装至 gentleMACS 组织解离器，运行程序“m_brain_03”。
- 将 C 管置于培养箱中，37 °C 旋转孵育 10 分钟。
- 短暂离心，使样品沉降至管底。
3. 过滤
- 选择一个孔径足够大的滤器，以允许目标细胞通过。例如，浦肯野细胞体积过大，无法通过 30 μm 滤器，但 Prominin-1+ 细胞可以。
- 使用合适的 1000 μl 移液器通过C管的隔膜密封盖吸取细胞，并将其加入置于 15 ml 收集管上的预分离滤器中。（注意：对于较大的样本量，请使用 50 ml 收集管）。
- 用 10 ml HBSS (w) 清洗滤器。
- 将滤过的细胞在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 将上清液重悬于您所选择的培养基或缓冲液中，用于后续实验。
- 为去除髓鞘碎片，使用髓鞘去除磁珠（Myelin Removal Beads）。
4. 代表性结果：请参见图1-3
图 1 使用 gentleMACS 解离仪进行脑组织解离后，流式细胞术分析显示细胞活力达 97%。
图 2 使用抗Prominin-1 MicroBeads进行磁性细胞分选后，在添加MACS Supplement B27 PLUS的MACS® NeuroMedium中培养7天后的神经球形成情况的光学显微镜图像。细胞来源于CD1小鼠脑组织（P3），使用神经组织解离试剂盒（P）制备。
图 3 单细胞悬液中的髓鞘碎片会显著影响细胞分离效果，使用髓鞘去除磁珠去除髓鞘碎片可提高细胞分选效率。采用抗 Prominin-1 微珠进行 MACS 分选时，使用神经组织解离试剂盒（P）解离 P22 小鼠脑组织。单细胞悬液中的细胞直接用于分选，或经髓鞘去除磁珠处理以去除髓鞘成分。比较经与未经髓鞘去除处理的样本分选结果表明，预先去除髓鞘的样本具有更高的纯度。
讨论
gentleMACS 组织解离仪可在封闭系统中实现神经组织单细胞悬液的标准化制备。神经组织解离试剂盒经过优化，可保留用于后续应用（如免疫染色和免疫磁珠细胞分选）所需的抗原表位1-5。本实验方案展示了使用 gentleMACS 组织解离仪和神经组织解离试剂盒（P）对小鼠脑组织进行温和酶解解离，获得细胞活力达 97%。每 100 mg 神经组织可获得 5×106 至 1×107 个细胞，具体数量取决于组织来源动物的年龄。目标 Prominin-1+ 细胞使用抗 Prominin-1 微珠进行分离，随后进行培养。当处理来自出生后 >P7 小鼠的神经组织时，联合使用髓鞘去除微珠可进一步提高分离效率。
披露
作者为德国 Miltenyi Biotec GmbH 公司的员工。
材料
参考文献
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