利用弹性蛋白酶建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型

摘要

本视频展示了如何通过将猪胰弹性蛋白酶短暂灌注至小鼠腹主动脉肾下段管腔内，从而在小鼠体内诱导腹主动脉瘤（AAA）。由于存在大量转基因和基因敲除小鼠，该模型能够为AAA的病理生物学机制提供广泛深入的见解。

摘要

自 Anidjar 及其同事首次在大鼠中描述以来，通过将猪胰弹性蛋白酶短暂灌注至肾下腹主动脉管腔内，已成为最广泛应用的腹主动脉瘤（AAA）动物模型。¹ 该模型的建立依据在于 AAA 中弹性蛋白结构的破坏。此大鼠模型已被改良，可用于在小鼠的肾下主动脉区域诱导 AAA。² 由于大量转基因和基因敲除小鼠的出现，该模型能够为 AAA 的病理生物学机制提供广泛深入的见解。此外，它也是一种可行的平台，可用于测试针对 AAA 的潜在治疗药物。在本视频中，我们展示了本实验室所采用的弹性蛋白酶灌注诱导 AAA 的操作流程。

使用2.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，并在无菌条件下进行剖腹手术。借助体视显微镜（Leica）分离腹主动脉。在近端和远端主动脉周围放置临时结扎线后，用30号针头尖端在主动脉分叉处做主动脉切口。将一段经热拉锥处理的PE-10聚乙烯导管经切口插入并固定。随后在100 mm Hg压力下，用含有I型猪胰弹性蛋白酶（4.5 U/mL；Sigma Chemical Co.）的生理盐水对主动脉腔进行灌注，持续5–15分钟。移除灌注导管后，修复主动脉切口，且不造成管腔狭窄。

方案

1. 使用吸入式异氟烷（2.0–3.0 mL/L）对小鼠进行麻醉。
2. 剃除腹部毛发，并用酒精和碘伏擦拭消毒。
3. 将小鼠仰卧位置于手术区域。
4. 术者佩戴无菌手套，所用器械经高温珠式灭菌器灭菌处理。
5. 沿腹中线做一长切口，用无菌纱布将腹腔内容物牵拉至腹腔外，以暴露腹主动脉。
6. 从左肾静脉水平至分叉处游离腹主动脉。
7. 暴露腹主动脉的分支，并用10-0缝线结扎；距离分叉处1.0 cm范围内的所有主动脉分支均需结扎。
8. 在主动脉近端和远端分别放置临时的6-0丝线结扎线。
9. 使用30号针头在分叉处切开腹主动脉（主动脉切开术）。
10. 将热拉细的聚乙烯导管（PE-10）经切口插入主动脉，并用结扎线固定。
11. 通过悬挂于136 cm高度的生理盐水袋校准压力至100 mmHg，向主动脉灌注含有4.5 U/mL I型猪胰弹性蛋白酶的生理盐水。在持续5–15分钟的弹性蛋白酶灌注过程中，主动脉通常扩张至原始直径的150–170%。
12. 随后移除灌注导管，并用10-0缝线缝合主动脉切口，以避免狭窄。
13. 关闭主动脉切口后，解除远端结扎线。
14. 若修复后的主动脉切口无明显或仅有少量出血，则解除近端结扎线；扩张后的主动脉立即充盈血液。
15. 将肠管还纳至腹腔，用6-0尼龙线或聚丙烯缝线分两层缝合切口。
16. 在切口处滴加0.25%布比卡因（每厘米切口长度约一滴），并皮下注射一剂卡洛芬（5 mg/kg）。
17. 将小鼠置于温暖区域，通常在15分钟内恢复清醒。

    图1. 弹性蛋白酶诱导腹主动脉瘤的代表性结果。

讨论

既往研究发现，不同商业化的弹性蛋白酶制剂在诱导腹主动脉瘤（AAA）形成方面存在显著的批间差异³。因此，必须对生产批次进行监控，并设置适当的对照组，以记录该制剂诱导AAA形成的能力。

有趣的是，该模型中腹主动脉瘤（AAA）形成易感性取决于所使用的小鼠品系³。本视频中使用的小鼠为 C57Bl/6 品系，采用所述方案可稳定诱导 AAA 形成。可根据其他品系的情况调整弹性蛋白酶浓度和/或孵育时间。

尽管在小鼠中利用弹性蛋白酶构建腹主动脉瘤（AAA）的技术具有较高的操作难度，但该技术对于研究AAA形成与发展的潜在分子机制至关重要。通过实践和技术改进，我们实验室已将成功率提高至90%以上。我们相信，本视频及配套文字将有助于降低希望采用该技术的实验室的学习曲线。

故障排除

1. 应用10-0缝线结扎腹主动脉的分支，以防止术中出血以及因渗漏导致弹性蛋白酶灌注时扩张不全。
2. 保持术野清晰和充分暴露非常重要，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ⅰ型猪胰弹性蛋白酶	试剂	Sigma-Aldrich	E1250
聚乙烯导管（PE-10）		BD Biosciences	427400
CHANGE-A-TIP		Bovie Medical Corporation	18010-00 (FST)	电凝刀
LEICA MZ6		Leica Microsystems		体视显微镜
LEICA DFC290HD		Leica Microsystems		USB相机
Image Pro Express ver. 6.0		Media Cybernetics Inc.		软件