通过采用新型的组织包埋和切片方法，并结合创新装置对多个游离脑片进行批量染色，可以在整个灵长类动物大脑范围内大规模检测目标蛋白。
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本文内容
摘要
摘要
免疫组织化学（IHC）是最常用的实验室技术之一，用于检测目标蛋白质in situ. 在使用免疫组化（IHC）研究小脑（如啮齿类动物脑）时，回答目标蛋白在整个脑区表达模式的问题相对容易。然而，在较大且结构复杂的脑组织（如灵长类动物脑）中回答相同问题则面临诸多挑战。本文介绍一种在成年猴脑中进行目标蛋白免疫检测的系统性方法。该方法基于神经科学协会（NeuroScience Associates, NSA）的组织包埋与切片技术，并结合专为游离漂浮切片批量染色而开发的工具。该方法可实现一组切片的均匀染色，这些切片以特定间隔覆盖整个脑组织。所得染色切片可进一步用于多种分析流程，以定量检测蛋白表达水平或表达特定蛋白的神经元群体。
方案
免疫组织化学是用于表征各种实验动物模型脑组织中蛋白质表达的最常用技术之一。对于大鼠及其他脑部大小相似的常见实验模型，系统性地开展免疫组织化学实验相对容易。然而，据我们所知，目前尚无已发表的研究全面介绍如何在整个猴脑范围内进行此类免疫检测操作。以下将详细描述如何对完整的猴脑进行处理，以实现多种靶蛋白的大规模免疫组织化学检测。本方法源于商业机构与学术研究的协作成果。因此，有关组织包埋和切片的具体细节仍属于NSA的专有技术信息。
第一部分：动物处理与组织制备
本方案使用成年绿猴（Cercopithecus aethiops）的大脑。所有操作均遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）关于生物医学研究中动物使用与护理的指南1。
- 动物通过肌内注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。
- 接着用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注约5分钟（约1升）。
- 取出的大脑置于梯度PBS缓冲蔗糖溶液（依次为10%、20%和30%）中，溶液中含0.02%叠氮化钠，4˚C保存，直至脑组织沉入容器底部。每隔数天更换一次溶液，直至进行冰冻切片。
- 脑组织送至NeuroScience Associates（NSA；田纳西州诺克斯维尔）进行处理，采用其专有的MultiBrain™包埋与冰冻切片技术。
- 在包埋基质中放置七个（7）个定位标记，以确保切片方向正确（即左右方向）并在完成组织学处理后可重新对齐。
- 在连续切片采集过程中，每次切片前均对切面进行数字摄影。这些数字图像以及脑切片后续可用于分别构建解剖学和组织学图谱的三维重建。
- 从整个脑组织采集连续的游离冠状切片，每片厚度为50 µm。
第二部分：组织学处理
按照特定的空间间隔（例如，500 µm）选取切片，出于本实验目的，使用以下抗体进行处理：脆性X智力低下蛋白（FMRP；Chemicon；美国加利福尼亚州特梅库拉）、SMI32（Sternberger Monoclonals Inc.；美国马里兰州巴尔的摩）和 NeuN（Chemicon；美国加利福尼亚州特梅库拉）。FMRP 是一种细胞质蛋白，在正常个体及携带脆性X前突变个体脑组织的神经元中含量丰富2。NeuN（神经元核蛋白）可特异性识别一种DNA结合型神经元特异性蛋白NeuN，该蛋白存在于大多数神经元中，分布于神经元细胞核、胞体以及部分近端神经元突起中3。SMI-32 是一种单克隆抗体，可识别神经丝蛋白上非磷酸化的抗原表位4。
- 每隔 500 µm，每种抗体大约使用 140 个切片。
- 所有孵育、洗涤和染色步骤均在专用染色皿和染色篮（HistoTools；Knoxville, TN）中进行，并施加轻微振荡。
- 为减少抗体分子的非特异性结合及由此产生的背景染色，切片首先在含有 0.1 M PBS/0.3% Triton X-100（TX）/5% 正常马血清（NHS）的溶液中孵育 60 分钟。
- 标记用于 FMRP 免疫染色的切片需额外进行抗原修复步骤，使用抗原修复液（Vector Labs；Burlingame, CA），操作按照供应商说明书进行。
- 随后，切片在各自的一抗溶液（含 0.1 M PBS/0.3% TX/3% NHS）中分别于不同日期过夜孵育（FMRP 和 SMI-32 抗体稀释比例为 1/5,000，NeuN 抗体稀释比例为 1/2,000）。
- 次日，切片在洗涤液（0.1 M PBS/0.3% TX）中洗涤三次，每次 10 分钟，随后在室温下与生物素化马抗小鼠二抗（Vector Labs；1/1,000 稀释于 0.1 M PBS/0.3% TX/3% NHS）孵育 2 小时。
- 再经过三轮 10 分钟洗涤后，切片在亲和素-生物素连接的辣根过氧化物酶复合物溶液（Vector Labs）中室温孵育 1 小时。
- 最后，在另一轮洗涤后，切片进行 10 分钟镍增强型二氨基联苯胺（Ni-DAB）反应，使免疫阳性神经元呈现深蓝色染色。
- 组织学程序完成后，将切片贴附于明胶包被的玻璃载玻片上。
- 所有切片均在空气中干燥过夜，并按照标准程序封片。
第3部分：代表性结果：
该方法可获得目标蛋白在整个猴脑中的完整表达谱。本文展示了代表性冠状切片，提供了同一只猴脑中FMRP、NeuN和SMI32表达情况的快照。
图1： 用于大规模批量处理游离切片进行免疫检测的染色皿（A）和篮框（B）。
图2： 用于FMRP（A）、NeuN（B）和SMI32（C）抗体染色的绿猴脑代表性冠状切片。
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讨论
该流程中有两个关键步骤，使得在整个猴脑范围内大规模检测蛋白质成为可能。其一是由NSA持有的专有技术——包埋与切片方案。其二是使用HistoTools公司提供的染色皿和染色篮。后者能够在同一时间方便快捷地处理大量（约40张）脑切片，同时确保全脑各切片处理条件的一致性，从而实现科学严谨的组织学处理。此外，通过使用嵌入式解剖标志物，还可进一步实现对干燥并加盖玻片的切片进行染色模式的数字化采集，并对所得数字图像文件进行多种分析。尽管本文仅展示了三种抗体的应用实例，但该方法同样适用于多种其他靶蛋白以及组织学染色技术，尤其是那些能够显示大脑皮层不同区域细胞构筑特征、因而可用于脑区定位与图谱绘制的染色方法。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Frank Ervin、Roberta Palmour 以及位于西印度群岛圣基茨的行為科學基金會實驗室的工作人员，感谢他们对我们灵长类动物研究工作的持续支持。本研究得到了加拿大脆性 X 综合征研究基金会（FXRFC）向 SZ 提供的博士后奖学金，以及加拿大卫生研究院（AC）和加拿大国家自然科学与工程研究理事会（MP）提供的运营基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗FMRP单克隆抗体 | Chemicon International | MAB2160 | 在固定组织中使用需进行抗原修复。 |
| 抗NeuN单克隆抗体 | Chemicon International | MAB377 | 不适用 |
| 抗神经丝蛋白H单克隆抗体 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | 不适用 |
| 抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 | 不适用 |
| 正常马血清 | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| 生物素标记的抗小鼠IgG（H+L），马来源 | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC试剂盒（标准型） | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| 用于漂浮切片的染色皿 | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| 染色运输篮 | HistoTools | 10012 | 大号 （适配12 x 65 mm染色皿） |
| 吐温X-100 | Fisher Scientific | P8514B | 不适用 |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | 不适用 |
参考文献
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
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