我们介绍一种用于在绵羊回肠内对“肠段”进行插管的新型外科手术方法。动物在术后恢复且抗生素和镇痛药物完全清除后，可通过导管直接向肠段内递送多种处理物质。
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本文内容
摘要
摘要
肠道是一个复杂的结构，不仅参与营养物质的吸收，还在个体与外界环境之间发挥屏障作用。因此，肠道在免疫监视及抵御肠道病原体方面起着关键作用。研究肠道生理学与免疫学常采用“肠道环段”作为实验模型。目前大多数环段模型均为不可恢复性外科手术模型，用于研究肠道在短期内（<24小时）发生的变化（1-3）。我们此前建立了一种可恢复性肠道环段模型，专门用于检测绵羊在接触疫苗、佐剂和病毒后，肠道内长期（<6个月）的免疫学变化（4）。该方法将处理措施局限在特定的“环段”区域，使我们能够对该部位的肠道进行取样。该方法的一个显著缺点是仅有一个给药时机（即手术时）。此外，肠道黏膜和管腔内容物的样本只能在实验结束时采集。上述模型其他重要的局限性在于，手术操作及相关术后处理措施（如抗生素和镇痛药的使用）可能直接影响处理因素本身和/或改变免疫功能，从而干扰实验结果。因此，我们对肠道环段模型进行了改进，将长期留置导管植入环段中。绵羊在手术后可完全恢复，且对外置导管无不良反应。值得注意的是，在环段中建立导管后，我们可在术后恢复期完成、且术中及术后用药已清除的情况下，在较长时间内多次给予不同处理。
方案
实验步骤：
- 所有器械均经高压灭菌；不可高压灭菌的材料须在Germex冷消毒液中灭菌，时间不少于10 min。
- 绵羊通过肌内注射给予乙酰丙嗪（0.05 mg/kg）、格隆溴铵（0.005 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（0.2 mg/kg）进行术前用药，之后静置15-20分钟。
- 颈部剃毛并进行外科刷洗。一旦可视化颈静脉，即在静脉上方皮下注射0.1 ml利多卡因，将导管插入静脉，并使用牲畜识别标签胶和2英寸医用胶带固定于皮肤。术中通过重力滴注给予动物Plasmalyte 148，剂量为10 ml/kg/hr。
- 地西泮（0.2 mg/kg）静脉注射，硫喷妥钠（10 mg/kg）诱导麻醉。利多卡因气管内喷雾用于声带，对绵羊进行气管插管，并以异氟烷（1.5–2.5% 溶于100% O₂）维持麻醉。2 以4 L/min的流速持续通氧至手术结束。
- 将动物置于加热垫上，呈仰卧位，以在手术期间维持体温。插入胃管至瘤胃，以防止过度膨胀。
- 剃除腹部腹侧毛发，使用三次普尔碘外科擦洗液对皮肤进行术前消毒。随后覆盖手术巾，确保手术区域（从脐部至腹部尾侧）充分暴露。
- 使用电刀从脐部开始向尾侧做一条15–20 cm的正中切口，于腹腔右下象限定位回盲皱襞。随后将远端回肠和盲肠提出腹腔外。整个操作过程中应尽量减少对肠管的牵拉，并注意保持外置肠段湿润，使用37–39°C无菌磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.2）
- 测量一段85 cm的回肠（即“肠段”），然后在该肠段两端分别用多伊恩钳（肠钳）和大型凯利钳夹住。在肠段内将建立“袢”以及袢之间的“间隙”。多伊恩钳置于将进行吻合（anastomosis）的一侧回肠端，凯利钳则置于肠段侧的回肠端。
- 在每把多伊恩钳和凯利钳之间剪断回肠，并用60 ml温热的磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔冲洗指定用于制备肠段环的肠道部分两次，以去除内容物。
- 广谱抗生素混合液（200 mg 芪诺沙星和 250 mg 甲硝唑溶于温热 PBS，总体积 60 ml）均匀分布于肠段内，作用 30 分钟。
- 将回肠近端和远端的断端（不包括肠段本身）进行吻合，以重建连续且具有功能的肠道通路。首先，在肠管的系膜侧和对系膜侧分别放置两针固定缝线，以对齐回肠断端。随后，采用连续单纯缝合方式（2-0 Vicryl缝线），从肠管两侧完成缝合，将两断端连接在一起。
- 在吻合口处注入温热的PBS（3-5 ml），以检查是否存在渗漏或缝线失效。随后，将Kelly止血钳的尖端紧贴吻合口附近的肠管浆膜表面，并在吻合口处向内推进，以确认肠腔足够宽敞且通畅。
- 从肠段中移除抗生素混合液。用可吸收缝线（2-0 Vicryl）采用连续单纯缝合方式闭合肠段两端，随后使用2-0 Vicryl进行内翻缝合。
- 85 cm长的肠段被分为三个15 cm长的“袢段”、两个位于袢段之间各15 cm长的“间隔段”，以及位于肠段两端各5 cm长的钝端腔室（图1）。袢段通过使用2-0丝线在肠管周围结扎形成。值得注意的是，在此操作过程中不结扎主要的肠系膜血管，以保证肠道的血液供应，维持肠组织的活性。此外，结扎线应留得较长，以便后续用于固定导管。
- 导管（即硅胶管）使用永久性记号笔进行单独标记。在距导管末端4–5 cm处放置一个环绕导管的硅胶球（直径5 mm），以帮助防止导管从肠管中滑出（图1）。经高压灭菌后，将一种非抗生素类软膏（Orbeseal）无菌地注入导管末端（3–5 mm），以确保导管保持通畅（即避免因肠袢内脱落的黏膜堵塞导管）。
- 在三个环的头端各做一个小切口。使用导管导入器（即“血管扩张器”）扩大每个切口，然后将一段6-8 cm长的导管向尾侧插入环内，直至硅胶球进入管腔（图1）。
- 用2-0 Vicryl缝线在导管周围行荷包缝合固定肠壁。通过将导管与标记肠袢头端的丝线结扎，进一步将导管固定于肠管上。
- 将氨苄青霉素（5 ml；100 mg/ml，溶于温热 PBS）注入每个肠袢及肠间隙，然后将肠道放回腹腔。通过腹部切口将头孢唑林（8 ml；100 mg/ml，溶于温热 PBS）注入腹膜腔。
- 在腹壁中线切口附近做一个小的穿刺切口，将导管从此处引出体外。
- 根据腹腔内导管的位置和张力进行调整。腹肌采用间断单纯缝合（可吸收缝线；Catgut #3）关闭，皮肤采用间断水平褥式缝合（不可吸收缝线；Supramid #1）关闭。
- 将一根弯曲的中空不锈钢管（内径 7 mm；外径 10 mm；长 65 cm）插入腹部切口附近的皮下，经皮下隧道引导至颈部后方肩部之间的出口位置。将导管插入该管中，并向前推进至少达到管长的 50%。然后从出口处的皮肤外拉出带导管的不锈钢管，使导管暴露出来。
- 在穿刺切口处调整导管张力，并使用Supramid #1缝线关闭皮肤。
- 单个导管被识别后置于绷带“袋”内，该袋使用Supramid #1缝线固定于皮肤上。该袋可保护导管免受后续损伤。
- 术后，绵羊肌肉注射氟尼辛（2.2 mg/kg，首次剂量），随后以维持剂量1.1 mg/kg，每日一次（s.i.d.），连续给药3天。同时，绵羊还分别肌肉注射止血敏（Hemostam，3 ml）和恩诺沙星（enrofloxacin，2.5 mg/kg），前者每日一次，持续3天，后者每日一次，持续5天。动物通过静脉持续输注含5%葡萄糖的Plasmalyte 148溶液，采用蠕动泵恒速输注，确保输注速率（145 ml/hr）不受体位影响。允许动物自由饮水。 随意摄取但需限制饲喂，直至瘤胃和肠道功能恢复正常。密切监测（每日两次）采食量、饮水量、体温、粪便和尿液排出情况、肠鸣音、腹部不适、精神状态及血糖浓度；必要时调整静脉输液中的葡萄糖浓度，以维持血糖在正常范围内。术前及术后立即检测血液生化和血液学指标（包括白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、淀粉酶、钙、胆固醇、肌酐、葡萄糖、无机磷酸盐、总胆红素、总蛋白、尿素、球蛋白、钠、钾、氯、氧分压、pH、二氧化碳分压、碳酸氢盐和总二氧化碳、红细胞和白细胞计数、红细胞压积、血红蛋白、白细胞分类计数和血小板计数），之后每隔一天检测一次。一旦肠道功能恢复正常，即停止静脉输液治疗，并将动物转移至围栏（即术后5–7天）。动物饲养于单独的圈舍中（彼此可见），以减少应激以及同伴啃咬导致导管袋受损的风险。
- 为将处理液注入单个循环管路，使用带有18号钝头针头的无菌注射器将5 ml处理液注入导管中。为确保全部处理液注入管路，随后再向导管内注入3 ml PBS。
关键点：
对手术成功至关重要的操作步骤包括：（1）在建立吻合口前，确认肠道未发生自身扭转；（2）确保吻合口的完整性和通畅性；（3）使用结扎线在标记肠袢头端的位置，将导管充分固定于肠袢壁，同时确保固定方式不影响导管的通畅性；（4）尽量减少对肠道的操作，并保证外置的肠道保持湿润；（5）确保导管张力适当；（6）在肌肉和皮肤缝合过程中，避免损伤导管的完整性；（7）防止绵羊术后过度进食（即在术后肠麻痹期间），以免引起瘤胃积食和瘤胃功能障碍；（8）确保动物在术后前3-5天接受足够的静脉输液治疗，密切监测血糖浓度，并根据需要调整静脉输液中的葡萄糖浓度，以预防低血糖。
图1. 带导管的回肠袢示意图。注意在绵羊回肠一段85 cm长的“肠段”内，建立了三个15 cm长的带导管“肠袢”、两个位于肠袢之间的15 cm长非导管“间隔段”，以及两个5 cm长的末端段。
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讨论
在本实验中，我们成功在绵羊回肠内建立的肠段中置入了导管。通过严格执行术后护理，动物在术后迅速恢复，并于手术后5-7天恢复正常的活动。我们确定，在肠段内建立导管不会影响肠道黏膜或免疫功能（数据未显示），且动物术后至少可存活8周。该方法使得在动物术后恢复期结束后，能够在较长时间内向不同的免疫区室引入多种处理，并对这些处理的生理和免疫学效应进行实证测量。
未来实验的一个重要考虑因素是小肠内肠段的位置。在本实验中，我们通过手术在“具有免疫功能的回肠”区域创建了肠段，该区域通常由回肠（连续性）派伊尔结（5,6）界定。这一区域可向前延伸至回盲褶上方约2米处。尽管从解剖学角度这一区域被视为空肠，但从免疫功能角度来看则属于回肠，这凸显了在描述肠道区域时需重视其功能特性。
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披露
所有涉及实验动物的操作均经机构动物护理委员会批准（动物使用协议编号 #0609），并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南。
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究的完成离不开加拿大阿尔伯塔省莱斯布里奇市加拿大农业与农业食品研究中心众多人员的奉献与努力。在此，我们感谢：Tara Shelton 在动物术前与术后护理、手术准备、麻醉学、样品分析以及视频成像方面的协助；Randy Wilde 和 Estela Costa 在术前与术后护理方面的贡献；Jenny Gusse 在样品分析方面的帮助；Byron Lee 提供的套管针图像；以及 Brian Egland 在绵羊饲养管理方面的支持。我们还感谢莱斯布里奇大学生物科学系的 Brent Selinger 提供视频设备与技术建议，以及其他协助（即执行制片），同时感谢莱斯布里奇大学课程再开发中心在视频拍摄方面的专业支持。本研究部分得到了先进食品与材料网络（G.D.I.）、加拿大—阿尔伯塔牛肉产业发展基金（G.D.I.）以及加拿大农业与农业食品部（G.D.I. 和 J.P.K.）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 外科手套 | 西部药品配送中心有限公司 | 103091 | |
| 外科口罩 | 西部药品配送中心有限公司 | MAX53013 | |
| 手术衣 | 加拿大魁北克省圣海辛特兽医药品分发中心公司 | 3365 | |
| OB围裙 | 西部药品配送中心有限公司 | 900062 | |
| 手术帽 | 西部药品配送中心有限公司 | 903271 | |
| EZ Scrub 刷子 | 西部药品配送中心有限公司 | BDC377479 | |
| 麻醉机 | 博伊尔 | - | |
| Sodasorb | 西部药品分发中心有限公司 | 108638 | |
| 喉镜 | 西部药品配送中心有限公司 | - | |
| 喉镜片（Miller喉镜片 #4） | 西部药品配送中心有限公司 | 902667 | |
| 气管插管（7.0 - 8.5 mm） | 西部药品配送中心有限公司 | - | |
| 利多卡因气管内喷雾 | 西部药品配送中心有限公司 | 103364 | |
| 乙酰丙嗪 | 西部药品配送中心有限公司 | AUS01020 | |
| 格隆溴铵 | 西部药品配送中心有限公司 | SAB2880 | |
| 酒石酸布托啡诺 | 西部药品配送中心有限公司 | AYE304541 | |
| 地西泮 | 西部药品配送中心有限公司 | sab790 | |
| 硫喷妥钠 | 西部药品配送中心有限公司 | 103508 | |
| 盐酸肾上腺素 | 西部药品配送中心有限公司 | 103856 | |
| 多沙普仑 | 斯特拉斯科纳药房 | - | |
| 异氟烷 | 西部药品分发中心有限公司 | 100339 | |
| Hemostam | 西部药品配送中心有限公司 | 103857 | |
| 氟尼辛 | 西部药品配送中心有限公司 | sch140100 | |
| 恩诺沙星 | 西部药品配送中心有限公司 | hll0049 | |
| 甲硝唑 | 西部药品分销中心有限公司 | 101653 | |
| 氨苄青霉素 | 西部药品配送中心有限公司 | NOV67185-6 | |
| 头孢唑林 | 西部药品配送中心有限公司 | nov69397 | |
| 电刀 | Macan | MV8 | |
| 加热垫 | Kane | PHMD-48 | |
| 胃管（Nalgene 软管 5/16）" ID | Fisher Scientific | - | |
| 持针器 | 西部药品配送中心有限公司 | 108338 | |
| 艾迪生·布朗镊子 | 西部药品配送中心有限公司 | 911075 | |
| 大鼠牙用镊 | 加拿大魁北克省圣海辛特市兽用药品分发中心公司 | 5275 | |
| 凯利钳 | 西部药品配送中心有限公司 | 901133 | |
| 蚊式止血钳 | 西部药品配送中心有限公司 | 108471 | |
| 卡马尔特钳 | 西部药品配送中心有限公司 | 901225 | |
| 手术刀柄 | 西部药品配送中心有限公司 | 900285 | |
| 22号手术刀片 | 西部药品分发中心有限公司 | 900511 | |
| 梅茨鲍姆剪刀 | 西部药品配送中心有限公司 | 901166 | |
| 锐-锐剪刀 | 西部药品配送中心有限公司 | 108264 | |
| 止血钳 | 西部药品分发中心有限公司 | 901213 | |
| 艾利斯组织镊 | 西部药品配送中心有限公司 | 901201 | |
| Doyen’s 钳 | 西部药品配送中心有限公司 | 904226 | |
| 不锈钢碗 | 西部药品配送中心有限公司 | 903601 | |
| 不锈钢穿刺器（弯曲型） | 本地供应商 | - | |
| 导管导入器 | 西部药品配送中心有限公司 | 11440 | |
| 手术巾 | 加拿大魁北克省圣海辛特市兽用药品分发中心公司 | 7972 | |
| 一次性铺巾 | 西部药品配送中心有限公司 | 900035 | |
| 无菌巾 | 加拿大魁北克省圣海辛特市兽药分发中心公司 | 2323 | |
| 盖布（40 x 40 cm） | 加拿大魁北克省圣海辛特兽用药品分发中心公司 | 8358 | |
| 手术巾（7" ×11 ¼" 开启 | 加拿大魁北克省圣海辛特市兽用药品分发中心公司 | 2694 | |
| Vicryl（2-0） | 西部药品配送中心有限公司 | JJMJ333H | |
| 丝线 2-0 | 西部药品配送中心有限公司 | 105248 | |
| 羊肠线 #3 | 西部药品配送中心有限公司 | CSL547-2070 | |
| Supramid #1 | 西部药品配送中心有限公司 | CSL547-3040 | |
| 缝合针（切割型与非切割型） | 西部药品配送中心有限公司 | - | |
| 硅胶管（0.040）" ID，0.085" OD | Fisher Scientific | 11-189-15D | |
| Orbeseal 软膏 | 西部药品配送中心有限公司 | 106344 | |
| 透明硅胶（732 多用途密封剂） | 本地供应商 | - | |
| 钝端针 | 西部药品配送中心有限公司 | 905035 | |
| 标记笔（工业用永久性） | 本地供应商 | - | |
| 导管袋（由7.5 cm弹力胶带制成） | 西部药品配送中心有限公司 | 104094 | |
| 医用胶带（2") | 西部药品配送中心有限公司 | 103842 | |
| 医用胶带（1") | 西部药品配送中心有限公司 | VLMRENF20 | |
| 4x4 纱布垫 | 西部药品配送中心有限公司 | 107551 | |
| 纱布粘连 | 西部药品配送中心有限公司 | 107633 | |
| Elastoplast 7.5 cm | 西部药品配送中心有限公司 | 104094 | |
| Elastoplast 可撕裂型绷带 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104093 | |
| 注射器（60 ml） | 西部药品配送中心有限公司 | 104004 | |
| 注射器（10 ml） | 西部药品配送中心有限公司 | bdc301604 | |
| 25G 针头 | 西部药品配送中心有限公司 | BDC305122 | |
| 20G 针头 | 西部药品配送中心有限公司 | BDC305175 | |
| 18G 针头 | 西部药品配送中心有限公司 | 903353 | |
| Intracath IV 导管（16G 8") | 西部药品配送中心有限公司 | bdc3831621 | |
| 静脉输液器（10滴） | 西部药品配送中心有限公司 | 101797 | |
| 0.9% NaCl 溶液 | 西部药品配送中心有限公司 | BAXJB1322P | |
| Plasmalyte 148 溶液 | 西部药品配送中心有限公司 | BAXJB2534 | |
| 葡萄糖 | 西部药品分发中心有限公司 | MCT60190 | |
| 蠕动泵 | Cole-Parmer | 7524-10 | |
| 家畜标识耳标粘合剂 | 本地供应商 | - | |
| Germex 溶液 | 西部药品配送中心有限公司 | mtc60270 | |
| 异丙醇 | 西部药品配送中心有限公司 | 104590 | |
| 斯坦己定清洁剂 | 西部药品配送中心有限公司 | 109248 | |
| Prepodyne 溶液 | 西部药品配送中心有限公司 | 105710 | |
| Prepodyne 擦洗剂 | 西部药品配送中心有限公司 | 105711 |
参考文献
- Vidal, J. E., McClane, B. A., Saputo, J., Parker, J., Uzal, F. A. Effects of Clostridium perfringens beta-toxin on the rabbit small intestine and colon. Infect. Immun. 76, 4396-4404 (2008).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet. Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
- Gerdts, V., Uwiera, R. R. E., Mutwiri, G. K., Wilson, D. J., Bowersock, T., Kindane, A., Babiuk, L. A., Griebel, P. J. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J. Immunol. Methods. 256, 19-33 (2001).
- Greibel, P. J., Davis, W. C., Reynolds, J. D. An analysis of the growth and differentiation of b cells isolated from follicles from ileal Peyer's patch of sheep. Immunology. 75, 601-607 (1992).
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