支架内再狭窄成像：一种经济、可靠且快速的临床前模型

摘要

本视频展示了如何使用一种临床前廉价且可靠的模型来研究支架内再狭窄发展的病理生物学和病理生理学过程。同时演示了利用光学相干断层扫描（OCT）进行体内纵向实时监测以及OCT图像的分析方法。

摘要

再狭窄的临床前模型对于揭示导致支架内再狭窄的病理生理过程，以及优化现有和未来的药物洗脱支架至关重要。

大鼠中可获得多种抗体以及转基因和基因敲除品系。因此，建立大鼠支架内再狭窄模型将便于开展病理生物学和病理生理学研究。

在本视频中，我们将介绍一种适用于高通量支架研究的大鼠支架模型的完整操作流程及注意事项。我们将展示支架植入的手术过程，并采用最精密的光学相干断层成像技术（OCT）来评估支架内再狭窄情况。该技术在评估斑块横截面积（CSA）方面具有高精度，且与组织学切片结果具有良好的相关性，而组织学切片需要特殊且耗时的包埋和切片技术。此外，OCT成像可实现对同一只动物体内支架内再狭窄发展过程的纵向动态监测，而组织学方法仅能提供单时间点的观察结果。

方案

主动脉支架置入

1. 从 Harlan 公司（美国印第安纳州印第安纳波利斯）购买体重为 550–600 g 的雄性 Sprague-Dawley 大鼠。在常规条件下饲养大鼠，自由摄取标准大鼠饲料和饮水。
2. 使用异氟烷（2%）和氯胺酮（25 mg/kg）对大鼠进行麻醉。在显微镜下进行上腹部正中微小剖腹术，暴露肾下腹主动脉。
3. 从肾动脉水平至分叉处，游离腹主动脉周围组织。注意：无需将主动脉与下腔静脉（IVC）分离。
4. 使用微血管夹阻断主动脉血流。先放置近端血管夹，再放置远端血管夹。
5. 在主动脉上做一小的横向切口，并用肝素（200 单位）冲洗主动脉。
6. 通过插入 2 法国规格的 Fogarty 动脉取栓导管（Baxter Healthcare，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）来去除主动脉内皮。
7. 使用长度在 8 mm 至 12 mm、直径在 2.5 mm 至 3 mm 之间的任何人用支架。注意：支架直径不应超过血管直径的 10%，以避免支架植入前后发生狭窄。注意：在同一项研究中不得更换支架长度。
8. 使用适当的球囊压力释放支架，以达到目标直径。
9. 使用 9-0 Prolene 缝线（Ethicon，德国诺德施泰特）逐层缝合小主动脉切口。
10. 使用 4-0 Vicryl 连续缝线（Ethicon，德国诺德施泰特）逐层关闭腹部切口。
    即使使用了 Vicryl 缝线，皮肤缝线仍应在术后 7–14 天内拆除。
11. 动物术中接受卡洛芬（6 mg/kg）给药，并在术后 7 天内通过饮水给予安乃近。

光学相干断层扫描（OCT）成像

使用M2 OCT成像系统（LightLab Imaging, Inc., Westford, MA, USA）获取OCT图像。ImageWire是一种成像探头，用于将光传递至组织并收集信号。ImageWire包含直径为0.006"（0.15 mm）的光纤核心，置于最大外径为0.019"（0.48 mm）的护套内。

1. 使用异氟烷（2%）和氯胺酮（25 mg/kg）对大鼠进行麻醉。在显微镜下进行正中再次剖腹手术，暴露肾下腹主动脉。
2. 夹闭近端腹主动脉及双侧髂动脉。
3. 在腹主动脉远端行横向动脉切开，使用28G导管以1 mL PBS冲洗，插入OCT导管并将其推进至主动脉内。
4. 以1.0 mm/s的回撤速度进行自动回撤OCT成像。
5. 以每秒15帧的速度采集图像；图像采用彩色查找表显示，并进行数字存档。
6. 闭合动脉切口。
7. 使用4-0 Vicryl连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合腹壁切口；
   即使使用Vicryl缝线，皮肤缝线仍需在术后7–14天内拆除。
8. 支架植入后6周内将达到最大新生内膜形成程度。

分析OCT图像

使用 LightLab OCT 成像专有软件并结合大鼠专用界面进行 OCT 测量。

1. 使用OCT成像导丝的反射信号对该系统进行校准，这是该系统的标准校准方法。
2. 以每1.0 mm为间隔，手动追踪管腔和支架的横截面积（CSA）。
3. 通过支架CSA减去管腔CSA计算斑块横截面积。将斑块CSA除以支架CSA得到斑块面积百分比（%），并计算平均斑块面积百分比。

OCT 技术的验证

OCT结果与组织病理学结果具有良好的相关性（图1）。组织学斑块横截面积（CSA）的计算方法如上所述。组织学显示内膜增生，伴有高密度的梭形细胞，仅见少量单核炎症细胞。6周后，支架被新生内膜肉芽组织完全覆盖，在2.5 mm支架中斑块CSA为1.3±0.4 mm²。

图1： 支架植入后6周的光学相干断层扫描（A）和组织学图像（B；放大倍数16倍）。由光学相干断层扫描图像获得的斑块管腔面积（CSA）结果与组织病理学结果高度一致。请点击此处查看图1的放大版本。

讨论

尽管兔髂动脉和猪冠状动脉模型是支架植入最常用的模型¹，但这些模型需要结合使用放射学和外科设备，动物饲养能力有限，且购买成本较高。大鼠支架模型的局限性在于必须使用专为大鼠设计的支架，金属与动脉的比例导致更严重的血管损伤²，以及血栓形成的人为高发生率³。

大鼠支架模型是一种简单、经济、快速且准确的临床前模型⁴。继Lowe等人首次报道直接在大鼠腹主动脉植入支架以来⁵，该模型在评估支架内再狭窄病理生理学方面的可行性与适用性已得到充分证实^5,6。大鼠腹主动脉的直径足以允许市售支架充分扩张，同时不破坏血管正常的生理结构。研究表明，在这些大鼠模型中，血栓形成、炎症反应以及平滑肌细胞（SMC）增殖等病理生理机制的发生过程，与兔和猪模型中的表现一致。因此，这些模型能够很好地模拟实际的再狭窄过程。

光学相干断层扫描（OCT）高分辨率成像技术可用于评估内膜增生。其穿透深度仅为1.5–2 mm，但分辨率比血管内超声（IVUS）高一个数量级^7,8。多项比较OCT与IVUS的研究得出结论：目前OCT是评估支架植入后新生内膜增生的首选技术^8–10。尤其是在血管直径较小的小型动物中，OCT的高分辨率使其成为评估再狭窄的最佳成像方式。

总之，本视频表明：（1）大鼠主动脉支架植入术易于实施；（2）大鼠腹主动脉支架植入适用于测试 commercially manufactured 支架；（3）OCT 成像是一种准确且精密的技术，可用于支架内再狭窄的长期监测。