初级培养的 Aplysia 感觉-运动神经元为研究突触形成和突触可塑性提供了一个模型制备系统 体外。本视频演示了从感觉神经元和运动神经元中进行识别与显微解剖的过程 Aplysia 神经节以及在培养中建立和维持感觉-运动神经元的方法。
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摘要
摘要
海洋软体动物Aplysia californica的神经系统相对简单，大约由20,000个神经元组成。这些神经元体积较大（直径可达1 mm），且具有可识别性，其大小、形状、位置和色素沉着各不相同，细胞体暴露于动物体内分布的五对神经节中。这些特性使得研究人员能够阐明动物特定行为背后的神经环路1。感觉神经元与运动神经元之间的单突触连接是该动物鳃收缩反射的核心组成部分，这是一种简单的防御性反射，当虹吸管受到触觉刺激时，动物会收缩其鳃。该反射可经历多种形式的非联想性和联想性学习，包括敏感化、习惯化和经典条件反射。对于突触可塑性的研究而言，特别有利的是，感觉-运动突触可在培养中重建，在此系统中，已明确的刺激可诱导出与动物行为直接对应的可塑性形式2,3。具体而言，5-羟色胺的应用会引起突触增强，其持续时间根据施用方案的不同，可维持数分钟（短期易化）、数小时（中期易化）或数天（长期易化）。相反，施用肽类递质FMRF酰胺则会引起突触减弱或抑制，其持续时间根据施用方案的不同，可持续数分钟至数天（长期抑制）。神经元的较大体积使得可在数天内反复使用尖锐电极记录突触强度，同时结合显微注射表达载体、siRNA及其他化合物，靶向特定的信号级联和分子，从而鉴定出突触效能变化背后的分子和细胞生物学机制。
Aplysia 培养系统的另一个优势在于 Aplysia 培养系统的一个额外优势在于神经元在培养中表现出突触特异性4,5因此，感觉神经元在培养中不会与自身（自突触）或其他感觉神经元形成突触，也不会与非靶向的已鉴定运动神经元形成突触。感觉神经元与运动神经元之间的突触接触部位——曲张体，直径足够大（2–7 微米），使得与靶向运动神经元之间的突触形成（以及突触形态的变化）可在光学显微镜水平进行观察研究。
在本视频中，我们将演示制备感觉-运动神经元培养物的每一步操作，包括对成年和幼年Aplysia进行麻醉、解剖其神经节、对神经节进行蛋白酶消化、通过显微解剖去除结缔组织、识别感觉神经元和运动神经元并通过显微解剖分离各类细胞、接种运动神经元、加入感觉神经元，并操作感觉神经元的神经突以使其与培养中的运动神经元形成连接。
方案
制备（溶液的组成详见方案末尾的溶液部分）
- 准备培养皿。用聚-L-赖氨酸（以硼酸钠溶液配制）包被Mattek玻璃底培养皿的玻璃孔，加入足量溶液以完全覆盖玻璃孔表面，并静置 > 1小时（可过夜放置）。用人工海水（ASW）彻底冲洗4-5次，完全去除聚-L-赖氨酸。最后一次冲洗液移除后，加入2 ml 50% L15培养基（添加盐类，L-谷氨酰胺终浓度为2 mM）与50%血淋巴的混合液。此培养基必须在接种细胞前至少提前1小时加入培养皿中，以确保血淋巴充分包被培养皿表面。
- 用乙醇清洁工具和Sylgard培养皿，用ddH₂O彻底冲洗20，然后将其放置于 >在培养罩内置于紫外光下1小时。
- 准备用于神经元显微解剖的尖锐电极。 使用微电极拉制仪（例如 Sutter Flaming Brown P-97），拉制外径为 1.5 mm、内径为 0.86 至 1.12 mm、长度为 100 mm 的玻璃移液电极（例如 AM system 目录号 #628000；World Precision Instruments TW150-4，1.55/1.12）。设置拉制参数，使电极尖端细长而纤细，电阻足够高，以至于将其置于溶液中时不会通过毛细作用吸入液体。若出现液体弯月面，说明电极尖端在神经元分离过程中可能对其造成损伤。Sutter 电极 Cookbook 提供了设置电极拉制程序的优良指南。我们采用盒式灯丝，通过一步拉制法制备用于培养的电极。
- 配制麻醉液（0.35 M MgCl₂）、培养基（L15 加入盐和血淋巴）和蛋白酶溶液（1% 蛋白酶 IX 型，Sigma，1 单位/毫克，终浓度为 10 单位/毫升）。
- 动物：使用成年个体，体重80-100 g Aplysia 用于分离感觉神经元和LFS运动神经元。使用1-4克重的幼年个体 Aplysia 用于分离L7运动神经元。将动物从海水水箱中轻轻取出，并在开始麻醉和培养程序前，将其保持在海水（烧杯、水桶或塑料袋中）中不超过30分钟。
培养步骤
A. 培养80-100克Aplysia的脑侧神经节感觉神经元
- 麻醉动物以取出神经节：使用60 ml注射器和18号1.5英寸针头，向成年加州海兔（Aplysia，80–100 g）体内注射0.35 M MgCl2。从动物足部以约35度角刺入，切勿过深，目标是将溶液注入血腔而不穿透内脏器官。注射后动物应明显膨胀并完全松弛。
- 解剖神经节：将麻醉后的动物置于解剖皿中，用针（对于80–100 g的动物，18号针头效果良好）固定头部和尾部，使足部朝上。用有齿镊夹住足部，使用手术剪沿足部全长（从头到尾）切开皮肤及下方结缔组织，将两侧组织向两边固定。用镊子和剪刀剪断食管并向一侧拉开，以暴露神经节。使用精细镊子和精细剪刀，取出足脑神经节（感觉神经元位于足脑神经节中）。保留较大部分的神经，以便在蛋白酶处理后更容易将神经节固定。
- 神经节的蛋白酶消化：将神经节置于蛋白酶溶液（L15培养基中含10 mg/ml、1单位/mg的蛋白酶）中，在34.5°C（34–35°C亦可）的培养箱中孵育2小时15分钟。使用细头镊子将神经节转移并用人工海水（ASW）清洗三次。清洗后将神经节保留在L15培养基中。注意蛋白酶孵育时间可适当调整，其目的是使结缔组织易于去除。若去膜时难以操作且易损伤神经元，则应延长蛋白酶孵育时间；若去膜过于容易且神经元质地“过软”，则应缩短孵育时间。
- 剥离神经节被膜：将经蛋白酶消化的神经节转移至含有Sylgard和L15培养基的60 mm或35 mm培养皿中。在体视显微镜（配备外部卤素光源）下，移除足神经节，并用昆虫针和精细镊子将足脑神经节以正确方向固定在Sylgard培养皿中。使用精细镊子和Vanna手术剪，小心提起结缔组织并剪除，以暴露感觉神经元簇。操作过程中切勿触碰或损伤神经元胞体。清除培养皿中多余的结缔组织，并补充新鲜培养基，确保去膜后的神经节始终不暴露于空气中。 感觉神经元簇由约200个直径为40–50微米的聚集神经元组成。在神经节附近适当距离（视野范围内）设置一根针作为“支点”。
- 神经元的分离：使用长而尖锐的玻璃培养电极，通过轻触神经元胞体偏离中心的位置（切勿刺穿），缓慢而稳定地将胞体连同轴突从神经节中拉出，逐个分离已识别的神经元。轻轻敲击支点针，使神经元从电极上脱落。
- 接种神经元：使用移液器（P10）将单个神经元从Sylgard培养皿转移至培养皿中。在转移前，先用移液器吸取少量培养基润洗枪头内壁，使塑料枪头表面被血淋巴蛋白包被（防止神经元粘附于塑料表面）。操作时务必避免神经元接触气泡或受到剧烈外力（即极其轻柔地吸取和释放神经元）。将神经元均匀分布于培养皿中。使用尖锐电极轻轻拉直神经突起，并轻敲使其贴附于培养皿底部。
- 孵育：将培养皿置于室温下的显微镜载物台上，静置不少于3小时，通常可过夜。在此期间确保载物台不受扰动，并用铝箔覆盖以避光。随后轻柔地将培养皿转移至18°C培养箱中继续培养。
- 神经元通常在约3小时内贴附于培养皿表面，新的神经突生长在约6–12小时内可见。分离的感觉神经元的生长在接种后第3至第4天达到平台期。需注意，分离的感觉神经元之间不会形成自突触或化学突触，尽管它们可形成电突触（缝隙连接）。
B. 感觉神经元-运动神经元共培养的制备
在培养条件下，感觉神经元可与靶向的运动神经元形成突触。最常用的运动神经元是来自腹神经节的 LFS 运动神经元和 L7 运动神经元。LFS 运动神经元来源于成年（80–100 g）Aplysia，每个腹神经节约有 20 个 LFS 运动神经元。L7 运动神经元则来源于幼年（1–4 g）个体，每个腹神经节仅有一个 L7。LFS 运动神经元直径为 40–50 微米，分布在腹神经节腹面、靠近虹吸神经根部的 LE 感觉神经元之间，其细胞体具有微弱的深色色素斑点作为特征。L7 运动神经元直径为 100–150 微米，位于神经节背侧左半部分的中边缘处。尽管使用 LFS 运动神经元更具经济性，但 L7 运动神经元较大的尺寸在某些实验中具有优势。L11 运动神经元也位于腹神经节背侧左表面，位置比 L7 更靠尾侧，属于非靶向运动神经元，可作为有效对照使用：感觉神经元可与其发生轴突束集，但不会形成化学突触。
- 为摘取神经节而麻醉动物。对于LFS运动神经元，操作步骤与胸神经节感觉神经元相同。对于L7运动神经元，使用10 ml注射器和21号针头，将0.35 M MgCl2注射到幼年Aplysia（1–4 g）体内。
- 解剖腹部神经节：将已麻醉的动物固定在解剖皿中（幼年动物使用21号针头），如上所述。使用精细镊子和精细剪刀，取出腹部神经节。
- 神经节的蛋白酶消化：操作方法与胸神经节感觉神经元相同，但幼年动物（1–4 g）神经节的消化时间缩短至1小时45分钟。
- 剥离神经节鞘膜：将经蛋白酶消化后的神经节转移至含有Sylgard和L15培养基的35 mm或60 mm培养皿中。在体视显微镜下（使用外部卤素光源照明），用昆虫针和精细镊子将神经节固定在Sylgard培养皿中，保持正确方向。使用精细镊子和Vanna手术剪，小心提起并剪除结缔组织，以暴露神经元胞体。为分离LFS运动神经元，将神经节固定，使其腹面朝上，用镊子向后拉松结缔组织鞘，暴露含有LFS运动神经元的半侧神经节（位于右侧），剥离神经节其余部分的鞘膜，清除培养皿中的所有结缔组织，并补充更多L15培养基。为分离L7或L11运动神经元，将神经节固定，使其背面朝上，用镊子向后拉松结缔组织鞘，暴露含有L7和L11的半侧神经节（位于左侧）。操作过程中务必避免触碰或损伤神经元胞体。在神经节附近适当距离处插入一根针，作为视野内的“支点”。
- 神经元的分离：使用锐利电极按感觉神经元的方法移除神经元。LFS神经元可通过其胞体内一个微小的深色色素斑点与邻近的LE感觉神经元相区分。L7神经元与L11神经元的区分依据包括：L11位于L7的尾侧，L11胞体呈更长的椭圆形而L7胞体更圆，且L11轴突在靠近胞体处倾向于分出两个分支。
- 神经元铺板：使用移液器（P10）将单个神经元从Sylgard培养皿转移至培养皿中，操作方法同感觉神经元。
- 与感觉神经元配对：让运动神经元在培养皿中贴附至少1小时。然后使用移液器加入已分离的感觉神经元，将每个感觉神经元置于已贴附的运动神经元旁边。使用锐利的玻璃电极小心拉直感觉神经元的轴突，并引导感觉神经元胞体靠近运动神经元，距离等于或略小于感觉神经元轴突的长度。用玻璃电极轻轻推动，利用锥形电极的侧面使感觉神经元轴突与运动神经元轴突实现物理接触。操作时不要抬起培养皿，而应轻轻推动培养皿沿显微镜载物台滑动。
- 将培养皿置于室温下的显微镜载物台上，静置不少于3小时，随后按感觉神经元的方法转移至18°C培养箱中。
- 培养物应在约3小时内完成贴附，新的神经突生长通常在6–12小时内可见。感觉神经元与运动神经元之间可迅速形成谷氨酸能突触——一旦细胞贴附程度足以进行锐电极记录（3–5小时），即可记录到兴奋性突触后电位。突触连接在培养第3天（DIV 3）前持续增加，之后至第7天（DIV 7）保持稳定。神经元在培养的最初一至三天内应表现出丰富的神经突向外生长。
C. 血淋巴的制备
血淋巴在 Aplysia 培养中用作生长因子（类似于胎牛血清在哺乳动物细胞培养中的使用）。采集自体型较大（500 克至 1 千克）的动物，据经验，采集血淋巴的最佳时间为春季（3 月中旬至 6 月）。用一次性护理垫将动物包裹，仅暴露一小部分身体，用乙醇清洁该部位皮肤，然后由一人固定动物，另一人使用无菌剃刀片在暴露区域做切口。挤压动物使血淋巴喷入洁净的烧杯中，注意避免接触动物被污染的皮肤。血淋巴充满动物的血腔（即动物本质上是一个血淋巴囊）。重新包裹动物一至两次，每次做新的切口并用力挤压，尽可能多地收集血淋巴（每次使用新的烧杯收集，以便在发生污染时仍可保留首次收集的样本）。每只动物的血淋巴应单独保存（即不要混合不同动物的血淋巴）。以 2000 × g 离心 10 分钟，去除血细胞。将上清液分装为每份 10 毫升，按动物编号标记，并储存在 -80°C。注意，储存在 -20°C 的血淋巴在培养基中会形成沉淀。每次配制培养基时必须使用新分装的血淋巴，并在配制前立即解冻。解冻后不得再次冷冻。
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讨论
成功制备 海兔 感觉-运动神经元培养的学习曲线相对较陡，因为该过程需要掌握在体视显微镜下进行显微解剖和单个神经元操作相关的精细运动技能。根据我们的经验，通常需要约1至3周的练习才能在培养中获得健康的分离感觉神经元，再需要额外1至3周的时间来学习如何将感觉神经元与运动神经元配对。我们通常在Labconco洁净工作台中制备培养物，但只要在培养过程中显微镜保持稳定（任何振动或机械扰动都会影响神经元的贴附），也可在任何实验台或桌面上进行。由于神经元在18℃的海水环境中生长°C，细菌和真菌污染的发生率明显低于哺乳动物细胞培养。培养制备过程中最重要的变量是动物的质量。 Aplysia 可直接从太平洋捕捞后向供应商购买（Alacrity 或 Marinus），或从迈阿密大学海洋养殖设施获得，该设施从太平洋采集繁殖对并在人工条件下培育 海兔 通过一个繁殖周期。因此，这些动物在遗传上具有异质性，而对于从海洋中采集的动物而言，其环境经历也存在异质性。所获取神经元的质量在不同季节间存在一定差异。 Aplysia，最差的时期通常出现在8月，另一个质量较低的时期在12月左右。另一个重...
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致谢
实验室中关于Aplysia神经元培养的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01项目和NIH R21MH077921项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
培养所需溶液
| |||
| L-15 粉末 | 13.8g | ||
| NaCl | 15.4 g | ||
| D-葡萄糖 | 6.24 g | ||
| MgSO₄4•7H20 | 6.45g | ||
| KCl | 350 mg | ||
| NaHCO₃3 | 170 mg | ||
| MgCl2•6H2O | 5.49 g | ||
| CaCl2•2H2O | 1.43g | ||
| HEPES | 3.53g |
参考文献
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
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- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, The MIT press. Cambridge. 213-236 (1998).
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