制备Aplysia 感觉-运动神经元细胞培养

摘要

初级培养的 Aplysia 感觉-运动神经元为研究突触形成和突触可塑性提供了一个模型制备系统 体外。本视频演示了从感觉神经元和运动神经元中进行识别与显微解剖的过程 Aplysia 神经节以及在培养中建立和维持感觉-运动神经元的方法。

摘要

海洋软体动物Aplysia californica的神经系统相对简单，大约由20,000个神经元组成。这些神经元体积较大（直径可达1 mm），且具有可识别性，其大小、形状、位置和色素沉着各不相同，细胞体暴露于动物体内分布的五对神经节中。这些特性使得研究人员能够阐明动物特定行为背后的神经环路¹。感觉神经元与运动神经元之间的单突触连接是该动物鳃收缩反射的核心组成部分，这是一种简单的防御性反射，当虹吸管受到触觉刺激时，动物会收缩其鳃。该反射可经历多种形式的非联想性和联想性学习，包括敏感化、习惯化和经典条件反射。对于突触可塑性的研究而言，特别有利的是，感觉-运动突触可在培养中重建，在此系统中，已明确的刺激可诱导出与动物行为直接对应的可塑性形式^2,3。具体而言，5-羟色胺的应用会引起突触增强，其持续时间根据施用方案的不同，可维持数分钟（短期易化）、数小时（中期易化）或数天（长期易化）。相反，施用肽类递质FMRF酰胺则会引起突触减弱或抑制，其持续时间根据施用方案的不同，可持续数分钟至数天（长期抑制）。神经元的较大体积使得可在数天内反复使用尖锐电极记录突触强度，同时结合显微注射表达载体、siRNA及其他化合物，靶向特定的信号级联和分子，从而鉴定出突触效能变化背后的分子和细胞生物学机制。

Aplysia 培养系统的另一个优势在于 Aplysia 培养系统的一个额外优势在于神经元在培养中表现出突触特异性^4,5因此，感觉神经元在培养中不会与自身（自突触）或其他感觉神经元形成突触，也不会与非靶向的已鉴定运动神经元形成突触。感觉神经元与运动神经元之间的突触接触部位——曲张体，直径足够大（2–7 微米），使得与靶向运动神经元之间的突触形成（以及突触形态的变化）可在光学显微镜水平进行观察研究。

在本视频中，我们将演示制备感觉-运动神经元培养物的每一步操作，包括对成年和幼年Aplysia进行麻醉、解剖其神经节、对神经节进行蛋白酶消化、通过显微解剖去除结缔组织、识别感觉神经元和运动神经元并通过显微解剖分离各类细胞、接种运动神经元、加入感觉神经元，并操作感觉神经元的神经突以使其与培养中的运动神经元形成连接。

方案

制备（溶液的组成详见方案末尾的溶液部分）

1. 准备培养皿。用聚-L-赖氨酸（以硼酸钠溶液配制）包被Mattek玻璃底培养皿的玻璃孔，加入足量溶液以完全覆盖玻璃孔表面，并静置 > 1小时（可过夜放置）。用人工海水（ASW）彻底冲洗4-5次，完全去除聚-L-赖氨酸。最后一次冲洗液移除后，加入2 ml 50% L15培养基（添加盐类，L-谷氨酰胺终浓度为2 mM）与50%血淋巴的混合液。此培养基必须在接种细胞前至少提前1小时加入培养皿中，以确保血淋巴充分包被培养皿表面。
2. 用乙醇清洁工具和Sylgard培养皿，用ddH₂O彻底冲洗₂0，然后将其放置于 >在培养罩内置于紫外光下1小时。
3. 准备用于神经元显微解剖的尖锐电极。 使用微电极拉制仪（例如 Sutter Flaming Brown P-97），拉制外径为 1.5 mm、内径为 0.86 至 1.12 mm、长度为 100 mm 的玻璃移液电极（例如 AM system 目录号 #628000；World Precision Instruments TW150-4，1.55/1.12）。设置拉制参数，使电极尖端细长而纤细，电阻足够高，以至于将其置于溶液中时不会通过毛细作用吸入液体。若出现液体弯月面，说明电极尖端在神经元分离过程中可能对其造成损伤。Sutter 电极 Cookbook 提供了设置电极拉制程序的优良指南。我们采用盒式灯丝，通过一步拉制法制备用于培养的电极。....

讨论

成功制备 海兔 感觉-运动神经元培养的学习曲线相对较陡，因为该过程需要掌握在体视显微镜下进行显微解剖和单个神经元操作相关的精细运动技能。根据我们的经验，通常需要约1至3周的练习才能在培养中获得健康的分离感觉神经元，再需要额外1至3周的时间来学习如何将感觉神经元与运动神经元配对。我们通常在Labconco洁净工作台中制备培养物，但只要在培养过程中显微镜保持稳定（任何振动或机械扰动都会影响神经元的贴附），也可在任何实验台或桌面上进行。由于神经元在18℃的海水环境中生长°C，细菌和真菌污染的发生率明显低于哺乳动物细胞培养。培养制备过程中最重要的变量是动物的质量。 Aplysia 可直接从太平洋捕捞后向供应商购买（Alacrity 或 Marinus），或从迈阿密大学海洋养殖设施获得，该设施从太平洋采集繁殖对并在人工条件下培育 海兔 通过一个繁殖周期。因此，这些动物在遗传上具有异质性，而对于从海洋中采集的动物而言，其环境经历也存在异质性。所获取神经元的质量在不同季节间存在一定差异。 Aplysia，最差的时期通常出现在8月，另一个质量较低的时期在12月左右。另一个重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养所需溶液 0.35 M MgCl2，室温保存，用于麻醉。 聚-L-赖氨酸溶液，Sigma：P-1524，MW &大于300,000，用0.1M pH8.2硼酸钠配制成0.5mg/ml溶液。充分涡旋混匀，并通过0.22 μm滤膜过滤除菌。 μm 滤器，4°C 保存°请勿冻融。 L-15 培养基干粉（Leibovitz）（Sigma：L4386），按以下成分添加盐类以配制 1 升培养基 <表格 边框="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
L-15 粉末	13.8g
NaCl	15.4 g
D-葡萄糖	6.24 g
MgSO₄4•7H20	6.45g
KCl	350 mg
NaHCO₃3	170 mg
MgCl2•6H2O	5.49 g
CaCl2•2H2O	1.43g
HEPES	3.53g

加 ddH₂O 至 1 升，pH 值应为 7.4–7.5，加入 10 ml 100× 青霉素/链霉素溶液，通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌 μm 滤器过滤。4°C 下保存不超过 1 个月。

蛋白酶消化液：使用前立即在L15（按上述添加盐类）或ASW中配制含1%蛋白酶IX（1单位/毫克）的溶液，并通过0.22微米滤膜过滤除菌 μm Millipore。5 ml 应足以用于两只动物的神经节（确保神经节完全浸没在蛋白酶溶液中）。Sigma 报告称将停止销售 Protease IX。替代用蛋白酶为：Dispase II（Roche Applied Science 目录号 # 04942078001）。

培养基。在制备培养物前立即取出一份10 ml的血淋巴解冻，并与10 ml L15培养基（按上述添加盐类）混合，配制成20 ml培养基。加入200 μ加入200 mM L-谷氨酰胺溶液1升，充分混匀后用于培养物的制备。每次制备培养物时均应新鲜配制该培养基。

人工海水可由 Instant Ocean（Aquarium Systems，Mentor，OH）配制，或按如下成分配制：450 mM NaCl、10 mM KCl、30 mM MgCl₂、10 mM CaCl₂、50 mM MgSO₄ 和 10 mM HEPES，用去离子水溶解，调节 pH 至 7.6。₂（6H₂O)，20 mM MgSO₄₄，10 mM CaCl₂（2H₂O)，10 mM HEPES，pH 调至 7.4。