人源CD40活化B细胞的制备

摘要

在本视频中，我们介绍了通过CD40配体和白细胞介素-4刺激，从外周血单个核细胞（PBMC）中ex vivo生成并扩增人CD40活化B细胞（CD40-B）的方法。

摘要

CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被确定为癌症免疫治疗中一种替代性的免疫刺激性抗原提呈细胞（APC）来源 ^1-3与树突状细胞（DCs）——目前研究最为透彻的抗原提呈细胞——相比，CD40激活的B细胞具有若干独特的生物学和实验操作特性。与DCs类似，B细胞在白细胞介素-4和CD40配体（CD40L）刺激后，MHC分子和共刺激分子的表达显著上调（图1b），表现出较强的迁移能力，并能高效地向T细胞提呈抗原。然而，与未成熟或成熟的DCs不同，CD40-B细胞表达完整的淋巴结归巢三联分子组合，包括CD62L、CCR7/CXCR4以及白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），这些分子对于归巢至次级淋巴器官至关重要（图1a）。 ³CD40-B细胞可从极少量外周血中无困难地制备，并可进一步扩增 体外 高纯度CD40-B细胞的大量制备（>10⁹ 每位患者细胞数）来自健康供体以及癌症患者（图1c,d） ^1,4.

在本实验方案中，我们演示了如何从人外周血单个核细胞（PBMC）获得完全活化的CD40-B细胞。细胞培养的关键分子包括CD40配体、白细胞介素-4（IL-4）和环孢素A（CsA），这些成分需在每3至4天的培养周期中补充。在实验室条件下，CD40刺激由表达重组人CD40配体的NIH/3T3细胞（tCD40L NIH/3T3）提供⁵。为避免非转染细胞的污染，必须定期检测转染细胞表面人CD40配体的表达情况（图2）。

14天后，CD40-B细胞培养物中B细胞纯度超过95%，且CD40-B细胞扩增可持续长达65天，通常不会丧失功能 ^{1, 4}CD40-B细胞能高效地摄取、加工并提呈抗原给T细胞 ⁶它们不仅能够启动初始ϊ但也能扩增记忆T细胞 ^7,8CD40 激活的 B 细胞可用于研究 B 细胞的活化、分化和功能，此外，它们也是用于肿瘤治疗性或预防性疫苗的有前景工具 ⁹.

方案

从外周血单个核细胞（PBMC）生成人源CD40活化B细胞的实验方案分为两部分：A部分演示表达CD40配体的NIH/3T3饲养细胞的制备，该细胞将用作板结合的饲养层细胞；B部分描述实际的CD40-B细胞培养过程。

A. 饲养层细胞的制备（tCD40L NIH/3T3）

tCD40L NIH/3T3 是一种贴壁生长的小鼠成纤维细胞系，不应使其完全汇合。因此，细胞需每周传代两次。不建议培养超过 6 周。

1. 用无菌移液管吸除原代培养物中的旧培养基，并用 10 mL 的 1× PBS 洗涤细胞。洗涤后吸除 PBS。
2. 在 75 cm² 培养瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶/EDTA，于 37°C 作用 5–10 分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。
3. 加入 10 mL 野生型培养基，轻轻旋转混匀。
4. 用无菌移液管将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在 225 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
5. 吸除上清液，将沉淀重悬于 10 mL 野生型培养基中。取部分细胞悬液计数细胞数量，并根据所需细胞数准备三个 50 mL 离心管：
   1. 用于传代培养的 1.5 × 10⁶ 个细胞
   2. 用于 CD40-B 细胞培养中照射的每孔 0.2....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 培养基的制备：
1. 饲养层细胞野生型培养基
DMEM-Ham’s / F12
L-谷氨酰胺 (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
2. 饲养层细胞筛选培养基
DMEM-Ham’s / F12
L-谷氨酰胺 (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B 洗涤培养基
IMDM
L-谷氨酰胺 (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
4. CD40-B 培养培养基
IMDM
L-谷氨酰胺 (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
重组人转铁蛋白 (50 μg/mL)
重组人胰岛素 (5 μg/mL)
AB型人血清 (10%)
B. 其他试剂：
DMEM / Ham’s F12	PAA Laboratories	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
AB型人血清	Invitrogen	Cat No 34005100
全铁人转铁蛋白	Sigma-Aldrich	Cat No T0665
人胰岛素	Sigma-Aldrich	Cat No I2643
庆大霉素®	Delta Select	Art No 7395800
重组人白细胞介素-4	Immunotools	Cat No 11130045
环孢素A	诺华公司 (Novartis AG)	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
HEPES缓冲液	PAA Laboratories	Cat No S11-001
G-418硫酸盐	PAA Laboratories	Cat No P02-012
胰蛋白酶/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. 其他耗材：
无菌移液器吸头	Sarstedt Ltd
6孔板	Nalge Nunc international	Cat No 140675
50 mL 锥形管	BD Biosciences	Cat No 352070
组织培养瓶	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002