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人源CD40活化B细胞的制备

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DOI：

10.3791/1373

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2009年10月16日

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1Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

本文内容

摘要

在本视频中，我们介绍了通过CD40配体和白细胞介素-4刺激，从外周血单个核细胞（PBMC）中ex vivo生成并扩增人CD40活化B细胞（CD40-B）的方法。

摘要

CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被确定为癌症免疫治疗中一种替代性的免疫刺激性抗原提呈细胞（APC）来源 1-3与树突状细胞（DCs）——目前研究最为透彻的抗原提呈细胞——相比，CD40激活的B细胞具有若干独特的生物学和实验操作特性。与DCs类似，B细胞在白细胞介素-4和CD40配体（CD40L）刺激后，MHC分子和共刺激分子的表达显著上调（图1b），表现出较强的迁移能力，并能高效地向T细胞提呈抗原。然而，与未成熟或成熟的DCs不同，CD40-B细胞表达完整的淋巴结归巢三联分子组合，包括CD62L、CCR7/CXCR4以及白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），这些分子对于归巢至次级淋巴器官至关重要（图1a）。 3CD40-B细胞可从极少量外周血中无困难地制备，并可进一步扩增 体外 高纯度CD40-B细胞的大量制备（>109 每位患者细胞数）来自健康供体以及癌症患者（图1c,d） 1,4.

在本实验方案中，我们演示了如何从人外周血单个核细胞（PBMC）获得完全活化的CD40-B细胞。细胞培养的关键分子包括CD40配体、白细胞介素-4（IL-4）和环孢素A（CsA），这些成分需在每3至4天的培养周期中补充。在实验室条件下，CD40刺激由表达重组人CD40配体的NIH/3T3细胞（tCD40L NIH/3T3）提供5。为避免非转染细胞的污染，必须定期检测转染细胞表面人CD40配体的表达情况（图2）。

14天后，CD40-B细胞培养物中B细胞纯度超过95%，且CD40-B细胞扩增可持续长达65天，通常不会丧失功能 1, 4CD40-B细胞能高效地摄取、加工并提呈抗原给T细胞 6它们不仅能够启动初始ϊ但也能扩增记忆T细胞 7,8CD40 激活的 B 细胞可用于研究 B 细胞的活化、分化和功能，此外，它们也是用于肿瘤治疗性或预防性疫苗的有前景工具 9.

方案

从外周血单个核细胞（PBMC）生成人源CD40活化B细胞的实验方案分为两部分：A部分演示表达CD40配体的NIH/3T3饲养细胞的制备，该细胞将用作板结合的饲养层细胞；B部分描述实际的CD40-B细胞培养过程。

A. 饲养层细胞的制备（tCD40L NIH/3T3）

tCD40L NIH/3T3 是一种贴壁生长的小鼠成纤维细胞系，不应使其完全汇合。因此，细胞需每周传代两次。不建议培养超过 6 周。

  1. 用无菌移液管吸除原代培养物中的旧培养基，并用 10 mL 的 1× PBS 洗涤细胞。洗涤后吸除 PBS。
  2. 在 75 cm2 培养瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶/EDTA，于 37°C 作用 5–10 分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。
  3. 加入 10 mL 野生型培养基，轻轻旋转混匀。
  4. 用无菌移液管将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在 225 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
  5. 吸除上清液，将沉淀重悬于 10 mL 野生型培养基中。取部分细胞悬液计数细胞数量，并根据所需细胞数准备三个 50 mL 离心管：
    1. 用于传代培养的 1.5 × 106 个细胞
    2. 用于 CD40-B 细胞培养中照射的每孔 0.2 × 106 个细胞
    3. 剩余细胞用于冻存（如需要）。
  6. 在 225 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
  7. 吸除上清液。
    1. 用于传代培养：将 1.5 × 106 个细胞重悬于 10 mL 野生型培养基中，接种至 75 cm2 细胞培养瓶（细胞密度为 1.5 × 105 个细胞/mL），加入 G-418 [0.7 mg/mL]，于 37°C、5% CO2 条件下培养。每周传代两次。
    2. 用于 CD40-B 细胞培养：每块 6 孔板需要 1.2 × 106 个细胞。将细胞重悬于野生型培养基中，细胞密度为 0.1 × 106 个细胞/mL，然后在 78 Gy 条件下进行照射。每孔接种 2 mL 细胞悬液，于 37°C、5% CO2 条件下培养。当 tCD40L NIH/3T3 细胞贴壁后（至少 4 小时：需在显微镜下检查贴壁情况；开始 B 细胞刺激的时间不得超过 24 小时），即可使用制备好的饲养层板进行 B 细胞刺激。（继续进行步骤 B。）

B. CD40-B 细胞培养

I. CD40 刺激用 PBMC 的制备（第 0 天）：

请注意：在继续操作前，需确认饲养细胞已贴壁。每次使用前，务必在培养基中立即加入新鲜的白细胞介素-4和环孢素A溶液。

  1. 取新鲜或适当复苏的外周血单个核细胞（PBMCs）。用50 mL 1× PBS重悬PBMCs两次以洗涤细胞，第一次以265 × g离心7分钟，第二次以190 × g离心7分钟，以去除其他细胞。弃去上清液，将细胞重悬于20 mL PBS中。取部分细胞悬液测定细胞数量。
  2. 以225 × g离心5分钟，沉淀所需数量的细胞。对于6孔板，每孔需要4 × 106个细胞，因此每块板共需24 × 106个细胞。
  3. 弃去上清液，将PBMC重悬于CD40-B培养基中，调整细胞密度为1 × 106个细胞/mL，培养基需新鲜添加50 U/mL白细胞介素-4（IL-4）作为生长因子，以及0.63 μg/mL环孢素A以抑制T细胞过度生长（所给浓度均指每毫升培养基中的含量！）。
  4. 移除预先与tCD40L NIH/3T3细胞共孵育的6孔板中的上清液。
  5. 先用每孔2 mL PBS洗涤贴壁的tCD40L NIH/3T3细胞，再用每孔2 mL CD40-B洗涤培养基进行第二次洗涤。
  6. 轻柔地向6孔板的每个孔中加入4 mL PBMC悬液（1 × 106个细胞/mL）。
  7. 将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养。
  8. 第7天时对细胞进行传代培养（继续执行3.2步骤）。

二、CD40-B 细胞的重新培养（第 7 天，之后每 3–4 天一次）：

  1. 用10 mL移液器重悬6孔板中的CD40-B细胞团簇，并将其收集至50 mL离心管中。
  2. 以225 × g离心7分钟，彻底弃去上清液，并用CD40-B洗涤培养基重悬细胞。在对部分细胞进行计数的同时，以225 × g再次离心5分钟。将CD40-B细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于CD40-B培养基中。
  3. 向培养基中加入终浓度为50 U/mL的白细胞介素-4和0.63 μg/mL的环孢素A新鲜溶液。
  4. 移除预先与tCD40L NIH/3T3细胞共培养的6孔板中的上清液。
  5. 先用每孔2 mL PBS洗涤贴壁细胞，随后再用每孔2 mL CD40-B洗涤培养基进行第二次洗涤。
  6. 轻轻向6孔板的每孔中加入4 mL（1 × 106 个细胞/mL）CD40-B细胞悬液。
  7. 将培养板置于37°C、5% CO2条件下培养。
  8. 每3–4天传代一次，经过总计14天后获得高纯度的人源CD40活化B细胞。

C. 故障排除——如果CD40-B细胞不生长怎么办？

  1. 您是否检测了饲养细胞的CD40配体表达？
  2. 用于刺激的平板包被饲养细胞使用时间是否未超过24小时？
  3. 是否存在支原体污染的可能性？
  4. 用于补充的白细胞介素-4溶液是否为 freshly thawed（新鲜解冻），并具有适当的生物学活性？
  5. 环孢素A是否以正确的浓度添加？

流式细胞术分析：CD标志物、荧光强度；图表显示免疫细胞活化研究。
图1. 请点击此处查看图1的放大版本。

流式细胞术 FACS 示意图：SSC 与 FSC 散点图、CD154 表达直方图、荧光强度。
图 2. 请点击此处查看图 2 的放大版本。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A. 培养基的制备：
1. 饲养层细胞野生型培养基
DMEM-Ham’s / F12
L-谷氨酰胺 (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
2. 饲养层细胞筛选培养基
DMEM-Ham’s / F12
L-谷氨酰胺 (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B 洗涤培养基
IMDM
L-谷氨酰胺 (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
4. CD40-B 培养培养基
IMDM
L-谷氨酰胺 (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
庆大霉素 (15 μg/mL)
重组人转铁蛋白 (50 μg/mL)
重组人胰岛素 (5 μg/mL)
AB型人血清 (10%)
B. 其他试剂：
DMEM / Ham’s F12PAA LaboratoriesCat No: E15-813
IMDMInvitrogenREF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)PAA LaboratoriesCat No H15-011
AB型人血清InvitrogenCat No 34005100
全铁人转铁蛋白Sigma-AldrichCat No T0665
人胰岛素Sigma-AldrichCat No I2643
庆大霉素®Delta SelectArt No 7395800
重组人白细胞介素-4ImmunotoolsCat No 11130045
环孢素A诺华公司 (Novartis AG)Cat No NDC 0078-0109-01
FBSLonza Inc.Cat No DE14-802C
HEPES缓冲液PAA LaboratoriesCat No S11-001
G-418硫酸盐PAA LaboratoriesCat No P02-012
胰蛋白酶/EDTA (10x)InvitrogenREF 15400-054
C. 其他耗材：
无菌移液器吸头Sarstedt Ltd
6孔板Nalge Nunc internationalCat No 140675
50 mL 锥形管BD BiosciencesCat No 352070
组织培养瓶Sarstedt LtdCat No 83.1813.002

参考文献

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

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CD40 4 A NIH 3T3

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