利用鲎，Limulus Polyphemus，进行视觉研究

摘要

在本视频中，我们使用美洲鲎（Limulus Polyphemus）进行视网膜电图记录、视神经记录以及视网膜内记录。这些电生理实验范式可用于科研或教学实验室中视觉神经机制的研究。

摘要

美洲鲎（Limulus polyphemus）是地球上最古老的生物之一，这种动物在生物医学研究中继续发挥着不可或缺的作用。它们的血液不仅含有特殊的细胞，可供科学家用于检测药品中的细菌内毒素，其眼睛还包含一个神经网络，为研究人类视觉系统中的生理过程（如光适应和侧向抑制）提供了重要见解。鲎之所以仍是视觉研究的理想模型，是因为作为无脊椎动物，它体型较大且生命力强，视网膜神经元体积大且易于获取，视觉系统结构紧凑且已被广泛研究，其视觉行为也已得到充分表征。此外，其眼睛的结构和功能每天都会受到动物大脑中昼夜节律钟的调节。简而言之，鲎的视觉系统足够简单，便于理解，同时又足够复杂，具有研究价值。

在本视频中，我们介绍了三种可在活体鲎（Limulus）上进行的电生理实验范式，用于研究视觉的神经基础。这三种方法分别为视网膜电图记录、视神经记录和视网膜内记录。视网膜电图（ERG）记录通过表面电极测量眼球中所有细胞对闪光刺激所产生的总和电反应，可用于长时间监测眼球的整体敏感性。视神经记录利用细胞外微吸电极测量单根神经纤维的动作电位活动，可用于研究从眼睛传递到大脑的视觉信息，以及从大脑反馈至眼睛的昼夜节律信号。视网膜内记录则使用细胞内微电极测量光刺激在眼球单个细胞中引发的电压波动，可用于阐明视网膜信息处理的细胞机制。

方案

第1部分：实验准备

对鲎进行的实验操作已获得波士顿大学机构动物护理与使用委员会的批准。动物购自海洋生物实验室（马萨诸塞州伍兹霍尔）或其他供应商，并饲养于暴露在受控明暗循环条件下的充气海水水箱中。光照方案对于同步鲎的昼夜节律钟，并使其眼睛每日在白天状态与夜间状态之间转换至关重要。在开始任何侵入性操作前，先将动物置于冰桶中冷却10至15分钟，直至其活动减缓，随后用两枚不锈钢螺钉固定于木质平台上，螺钉插入头胸部和两枚插入腹部。平台底部配有花岗岩配重，使其可在水中下沉。终末实验结束后，通过再次将动物浸入冰浆并用手术刀刺穿位于口部上方的脑组织以实施安乐死。

第二部分：溶液

鲎林格氏溶液由 430 mM NaCl、9.56 mM KCl、9.52 mM CaCl2、9.97 mM MgCl2、21.05 mM MgSO4 组成。 50μM TES 50μM HEPES 和 10 ml/L 青链霉素混合液（青霉素-链霉素，10000 单位/毫升）。

第3部分：视网膜电图记录

本实验所需的工具包括螺丝刀、凡士林、林格氏液、移液管、绿色LED灯、记录室、不锈钢螺丝和棉签。

1. 使用一个自制的记录室来记录视网膜电图（ERG）（图1A）。记录室主体设计用于容纳与眼睛接触的生理盐水储液池。室盖上包含一根氯化银导线，用于将导电溶液连接至放大器，以及一个可容纳LED的小孔。峰值发射波长约为520 nm的超亮LED效果最佳。
2. 开始时，将记录室底面涂上石蜡油，并用两枚螺钉将其固定在眼睛上方。
3. 然后向记录室中注入生理盐水，并盖上室盖。
4. 安装记录室后，将蟹置于一个避光的笼子中，笼子放置于盛有海水的水槽内，海水需覆盖其鳃部。
5. 将LED电缆插入记录室盖上的小孔。
6. 将信号导线夹在氯化银导线上，参考导线夹在其中一枚植入的螺钉上。
7. 两根导线均连接至高阻抗差分放大器（X-cell 3x4，FHC Inc）的前置端以进行信号放大，并将放大器滤波器设置为仅通过低于10 Hz的频率信号。
8. 放大器输出信号被送至示波器用于实时观察，同时输入数据采集板以进行计算机分析和存储。
9. 系统设置完成后，关闭笼门以防止室内光线照射到动物。
10. 使用基于LabView编写的自定义程序采集数据。该程序控制LED闪光，记录诱发出的ERG信号，并测量峰-峰反应幅度。闪光刺激范式的选择取决于实验目的。例如，在监测眼敏感度的昼夜节律变化时，每隔10分钟向LED施加一次短暂（100 ms）的5 V脉冲，可避免光适应效应的影响。

第4部分：视神经记录

本实验所需的工具包括螺丝刀、缝合线、环钻、林格氏液、咬骨钳、Vannas 剪刀、记录室、弯头镊子、细针探针、钝性手术刀、手术剪和吸引电极。

1. 使用一个手工制作的记录室来记录视神经反应（图1B）。该记录室内部为直径2 cm的开放腔室，其底部壁上有一个细长的半圆形槽口，用于容纳视神经并将其与周围组织隔离。
2. 在安装记录室之前，将一根16号针头插入铰链肌之间的心脏中，从动物体内抽出约20 cc血液。放血并非必需步骤，但可使视神经解剖更为容易。
3. 通过在头胸甲上画一条连接侧眼与中眼的轻微弯曲线条，估算视神经的位置。
4. 随后使用环钻在头胸甲上切割出一个圆形孔洞，其直径与记录室腔室相同。孔洞中心位于侧眼前方2–3 cm处，并略偏背侧，以确保神经沿腔室腹侧走行。
5. 清除结缔组织，直至视神经完全暴露，并与周围及下方组织完全分离。
6. 将一根细线缠绕在神经上，通过底部的槽口将其拉入记录室。通过同一开口，轻柔地牵拉细线以引导神经进入腔室，同时将记录室腔体插入孔洞中。随后用螺钉将记录室固定在头胸甲上，并向腔室内注入任氏液（Ringer's solution）。
7. 安装记录室后，将动物置于充满海水的水箱中，并用避光笼覆盖以保持黑暗环境，海水需覆盖鳃部。
8. 在体视显微镜（SMZ-168, Jed Pella Inc）下观察腔室，用棉片垫在底部开口周围，防止血液流入或盐溶液从记录室漏出。
9. 使用精细剪刀和镊子去除神经周围的残余结缔组织，并重新注入新鲜任氏液。
10. 在包裹神经的血管上切开一小口，通过该开口使用精细剪刀、镊子和探针沿神经全长小心剥离神经鞘膜。
11. 使用探针从神经中分离出一小束纤维，并根据记录需求在远离眼睛的一端切断以记录传入纤维信号，或在靠近眼睛的一端切断以记录传出纤维信号。视频中展示的是传入纤维记录端的切断操作。
12. 使用充满任氏液的微吸电极（A-M Systems Inc）进行视神经信号记录。电极尖端由直径1 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管经火焰抛光制成，以适配神经束。
13. 通过手动操作器（WPI Inc）将电极尖端 lowered 至记录室腔内，并将切断的纤维束吸入电极尖端。负压由通过导管连接至电极的Gilmont注射器提供。
14. BNC接口作为信号导联，参考导联则由缠绕在电极上的氯化银导线构成，以降低噪声。两条导联连接至差分放大器的前置放大级（X-cell 3x4, FHC Inc），用于信号放大与噪声滤除。放大器输出信号被传送至示波器用于实时观察，并通过数据采集卡传输至计算机进行分析与存储。
15. 使用基于LabView编写的自定义程序采集数据。该程序通过数字视频处理器（Bits++, Cambridge Research Systems Inc）控制光刺激，并与数字峰电位鉴别器（APM, FHC Inc）通信，用于记录峰电位序列。光刺激可通过光纤导光管传递至眼内单个细胞，或通过计算机控制的视频显示器作用于整个眼睛。

第5部分：视网膜内记录

本实验所需的工具包括螺丝刀、带螺纹螺孔的L形有机玻璃平台、带玻璃移液管的微电极夹持器、不锈钢螺丝、镊子和精细手术刀。

1. 使用一块带有预设螺孔的手工亚克力板记录细胞内反应。螺孔间距专为安装电动显微操作器（PPM5000，WPI Inc）设计。该板通过两侧各一个、顶部一个共三颗螺丝固定在动物体上。
2. 安装好亚克力板后，将动物置于一个避光的笼内，并将其放入盛有海水的水箱中，使海水覆盖鳃部。
3. 将显微操作器旋入亚克力板，使其可移动臂对准眼睛上方。
4. 使用外径1 mm的硼硅酸盐玻璃管拉制一批玻璃微电极，并通过毛细作用将电极尖端浸入盛有3M KCl溶液的小瓶中进行反向填充。
5. 随后手动将其余部分用盐溶液充满，并插入电极夹持器中。
6. 电极夹持器连接至固定在显微操作器臂上的细胞内放大器（IR-283，Cygnus Technology Inc）的前置放大级。
7. 用刀片切除角膜界面，暴露出一小片视网膜区域（约1 mm²）。
8. 在暴露的视网膜上滴加一滴任氏液以防止干燥，并将微电极尖端经切口推进至视网膜组织中。
9. 当电极尖端进入溶液时，启动细胞内放大器的电流注入模式并测量电极阻抗。阻抗不在20–70 MΩ范围内的微电极予以弃用。阻抗在此范围内的电极以微米步进方式推进，并通过电子或机械振动方式刺入细胞。
10. 在眼内可能遇到三种类型的细胞：光感受器细胞仅对光刺激产生去极化反应，偏心细胞在去极化反应基础上产生一串动作电位，而色素细胞则完全无光反应。
11. 数据由基于Labview编写的自定义程序采集。该程序通过数字视频处理器（Bits++，Cambridge Research Systems）控制光刺激，刺激信号通过光纤导管或视频显示器传递至被刺入的细胞。电压反应在示波器上观察，并由程序进行数字化后传输至计算机。

第6部分：代表性结果

图2A显示了一个典型的ERG波形。该波形主要代表感光视细胞对光刺激产生的总和电反应，因为这类细胞的数量远超偏心细胞，并且在电学上与后者相耦合。与哺乳动物的ERG不同，该波形并不包含来自不同类型视网膜细胞的多个成分。来自鲎脑内生物钟的昼夜节律反馈每日调节视网膜细胞的生理特性，导致ERG的振幅和时间进程随时间发生变化（1）。如图2B所示，ERG振幅在动物的主观夜间最高，而在主观白天最低。

单根视神经纤维对光反应的代表性轨迹如图3所示。所有偏心细胞的行为大致相同，均表现出放电频率的短暂升高，随后衰减至一个持续的水平。频率的衰减反映了光适应和放电依赖性自我抑制共同作用于偏心细胞的结果（2）。其他类型的放电模式，例如随光照减弱的放电频率，在鲎脑中可见，但在眼内未观察到（3）。

图4显示了色素细胞、小眼细胞和偏心细胞对光刺激的电压反应的代表性轨迹。只有后两种视网膜细胞具有感光功能。它们的反应幅度和时间进程取决于记录质量以及电极在细胞内的位置。通常情况下，由于色素细胞和小眼细胞体积较大且数量较多，电极更容易穿透这两类细胞。若电极进入小眼细胞，可记录到先出现短暂的去极化，随后衰减至一个持续水平的反应。这种衰减现象是由于小眼细胞的光适应所致（2）。若电极进入偏心细胞，则可在轴突中记录到较大的动作电位（40–70 mV），而在胞体附近则可记录到叠加在去极化波形上的较小动作电位（<25 mV）。

图1. 用于视网膜电图记录（A）和视神经记录（B）的记录室示意图。A中的标尺为7 mm，B中为5 mm。

图2. 鲎在暗处由持续100毫秒、5V的LED脉冲诱发的视网膜电图（ERG）示例记录（A），以及在持续黑暗条件下ERG振幅随时间变化的峰-峰值波动（B）。白色三角形所示时间点标志着黑暗环境的开始。从该时间点至黑色三角形所示时间点之间ERG振幅的上升是由于光适应过程，该过程提高了眼睛在暗处的敏感性。此后ERG振幅的周期性波动则源于动物自身的内在昼夜节律钟。图B中的时间间隔为每5分钟。

图3. 单根视神经纤维对单个单眼感受器闪光刺激的反应示例轨迹。轨迹上方的波形表示刺激时序。在本实验的光照条件（在完全黑暗中持续5秒的闪光）下，所有 eccentric 细胞（其轴突形成神经纤维）均表现出与此相似的放电模式。以脉冲方式进行视网膜编码是鲎（Limulus）与哺乳动物共有的特征，而不同于其他无脊椎动物。

图 4. 鲎侧眼中的三种细胞类型对光刺激的电压反应示例迹线：色素细胞（A）、视网膜细胞（B）和偏心细胞（C）。第一种细胞无视觉功能。后两种细胞在光脉冲作用下发生去极化。视网膜细胞的去极化幅度最大，因为它们负责光信号的转导，并通过缝隙连接将信号传递至偏心细胞，过程中存在部分信号衰减。在偏心细胞中，轴突产生的动作电位叠加在去极化电位上，这是动作电位逆向传播至胞体所致。图中已降低动作电位的幅度，以便更清晰地观察去极化电位。这些细胞的静息电位为 -50 mV。

讨论

我们已阐述了如何在活体鲎上进行视网膜电图（ERG）记录、视神经记录以及视网膜内记录。这些记录技术各自提供了关于视觉神经基础的不同见解，且由于鲎具有较大的眼睛和坚硬的头胸甲，所有这些技术均可用于研究活体动物的视网膜功能。通过适当构建电极，甚至可在海洋中自由活动的动物身上记录视神经活动（4）。这些技术也可在离体眼睛上进行，仅需对实验装置做轻微调整。然而，此类实验与自然状态的相关性有限，因为当眼睛被从动物体内取出后，其生理特性会发生改变（5）；但对于教学实验室而言，鉴于这些方法在神经科学中的广泛应用，其教学价值仍然很高。

为了清晰起见，此处分别介绍视网膜电图（ERG）记录、视神经记录和视网膜内记录。在实际操作中，通常在一个实验中结合多种记录方法，以同时监测一只或两只侧眼神经活动和视觉敏感性的变化。我们用于ERG记录的小型记录室在这方面相比其他设计具有明显优势（1, 6）。此外，该记录室可容纳一个与空气隔离的生理盐水储液池，从而避免了传统棉线电极因随时间推移而干燥所导致的稳定性问题。利用鲎（Limulus）可开展的视觉实验范围甚至更为广泛，因为用于神经记录的相同操作步骤，只需将电极导线...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LED	光源	Newark Inc	33C1292
负压电极	电极	A-M Systems	573000
XCell 3*4-通道细胞外放大器	放大器	FHC, Inc.	40-40-8B
细胞内记录	放大器	Cygnus	IR-283A
APM	神经放电鉴别器	FHC, Inc.	APM
Bits++	视频板	剑桥科研系统公司	Bits++
Piezopatch 操纵器	微位移器	世界精密仪器公司	PPM5000
方波脉冲刺激器	神经刺激器	Grass Technologies	Model S48
P-97	微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	Model P-97
硼硅酸盐玻璃毛细管	电极玻璃管	世界精密仪器公司	1B150-4
马蹄–蟹（Limulus polyphemus）	实验动物	海洋生物实验室
微电极拉制仪	玻璃拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
变倍体视显微镜	显微镜	Jed Pella Inc.	SMZ-168