我们描述了一种 体内 通过将GFP标记的成肌细胞移植到健康和肌营养不良小鼠的骨骼肌中，利用荧光成像方案监测肌肉再生。该方案可适用于其他类型细胞的移植研究，以及多种其他肌肉状况下的肌肉再生研究。
本文内容
摘要
摘要
肌营养不良症是一组以进行性丧失收缩性肌细胞为特征的变性肌病。目前尚无治愈性治疗方法。干细胞生物学领域的最新进展为开发有效的细胞治疗手段以治疗这些疾病带来了新的希望。将用荧光蛋白标记的各种类型干细胞移植到肌营养不良动物模型的肌肉中，已在该领域得到广泛应用。一种能够纵向追踪移植细胞命运的非侵入性技术，可进一步提高我们对移植细胞肌肉植入效果进行更准确、更高效评估的能力。
在本研究中，我们证明了 体内 荧光成像是一种灵敏且可靠的方法，可用于追踪移植到小鼠骨骼肌中的GFP（绿色荧光蛋白）标记细胞。尽管使用外部激发光可能引起背景信号的担忧，但我们发现，通过使用裸鼠或使用脱毛试剂去除毛发，可显著减轻这一问题。利用CCD相机，在向胫骨前肌（TA）注射5 x 105 来自GFP转基因小鼠或eGFP转导的成肌细胞培养物的细胞。对于趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）等较表浅的肌肉，注射较少数量的细胞即可产生可检测的信号。信号强度可通过感兴趣区域（ROI）内每秒发射的光子数进行测量和量化。由于所获得的图像可清晰显示移植区域的边界，因此也可测量ROI的大小。若每次实验均保持腿部位置一致，则每块肌肉每秒光子总数及ROI大小的变化可反映移植细胞数量及移植区域大小的变化。因此，同一肌肉随时间变化的情况可被定量分析。 在体 荧光成像技术主要被用于追踪肿瘤细胞的生长，而我们的研究表明，它也是一种强大的工具，使我们能够追踪移植干细胞的命运。
方案
细胞制备
- 卫星细胞分离
- 在麻醉状态下，取 GFP 转基因小鼠（C57BL/6J-Tg-βactin-EGFP）的肢体肌肉组织。将肌肉切成小块后，加入 2% dispase 胶原酶溶液，于 37°C 孵育 1 小时，通过酶解法分离卫星细胞。
- 用含Ham F-10和20% FBS的生长培养基中和酶消化反应，通过反复吹打Pasteur移液管解离肌肉组织。细胞经细胞滤网（ø70-100μm）过滤后，接种于未包被培养皿中，在37°C孵育1小时。
- 轻轻吸去上清液，将细胞接种至胶原包被的培养皿中。1小时后重复此步骤，以纯化成肌细胞。（预铺板）
- 及时更换培养基并接种细胞。最终纯化的成肌细胞在含有Ham F-10、20% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（生长培养基）的培养基中，于37°C、5% CO2和95%空气条件下培养。
- 在添加了10 ng/ml基础成纤维细胞生长因子（bFGF）的生长培养基中培养并扩增原代成肌细胞。
- 对于所有 体内 实验中，我们注射 5x105 每块TA肌肉的细胞数
- 收获成肌细胞时，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将细胞消化解离，并用PBS洗涤两次。用血细胞计数板计数细胞数量，然后将细胞重悬于HBSS中，浓度为5×10⁶个/mL。4 细胞/μl。收集后1小时内将HBSS中的浓缩细胞置于冰上并进行注射。
体内 成像
- 从杰克逊实验室购买4至6周龄的雄性mdx小鼠，并在动物饲养设施中进行维持。
- 经过约一周的环境适应后，小鼠即可接受培养细胞的移植。
- 在细胞移植前，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的混合物使小鼠麻醉。随后，在腿部涂抹Nair去除胫前肌区域的毛发，等待30秒后用蒸馏水擦拭干净。
- 在小鼠仍处于麻醉状态下，注入5x105 使用30号针头，将10μl HBSS中的细胞缓慢注射到每侧TA肌的3个位点。
- 在第4步之后，可以对小鼠进行常规成像 体内 荧光成像。使用配备高灵敏度电荷耦合相机的NightOwl LB981荧光成像系统（Berthold Technologies, Inc.）获取小鼠后肢的荧光图像。
- 在当天 体内 成像前，我们首先检查TA肌肉区域的毛发再生情况。如有必要，在用氯胺酮和赛拉嗪混合物麻醉小鼠后，按照上述方法重新涂抹Nair去除毛发。
- 在小鼠处于麻醉状态时，将其俯卧于一张黑色非荧光纸（Strathmore 公司的黑色 Artagain 纸）上。为充分暴露胫骨前肌以利于成像，用胶带将后肢足掌固定于纸上。
- 将小鼠放入成像室，使待成像的后肢位于相机视野中心。首先更换发射滤光片，以5秒曝光时间拍摄后肢的传统灰度照片。如有必要，重新调整小鼠位置和相机焦距。实验过程中保持成像参数恒定，包括曝光时间（1,250 ms）、样品高度（0.9 cm）等。
- 然后切换至适合绿色荧光蛋白波长的发射滤光片。以1,250 ms的曝光时间和1×1的像素合并模式采集荧光图像。成像完成后，将小鼠从成像室取出并放入饲养笼中等待恢复。
- 为进行分析，我们在荧光信号上绘制感兴趣区域（ROI），以测量其强度，单位为每秒光子数。同时，我们还测量ROI的像素数量，作为另一量化指标。若需获取纵向数据，成像实验可每周或更频繁地重复进行，持续数月。
实验结束后，处死小鼠并取胫骨前肌进行组织学分析。
讨论
本研究建立了一个可靠且稳定的成像平台，用于在宿主骨骼肌中追踪荧光标记的移植细胞。来自绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的GFP标记成肌细胞代表一类成体干细胞，未来有望成为细胞治疗的候选细胞。为获得高质量图像，尤其是进行定量分析，保持细胞数量、细胞注射、背景清晰度、成像位置及仪器参数的一致性操作至关重要。
荧光成像在生物医学研究中具有多种应用，因其具有非侵入性、操作简便以及高通量的优点。此外，荧光成像还可基于光子计数提供定量测量，但由于光在组织中会发生散射、衰减和吸收，难以穿透较深的组织，这是该技术的局限性之一。目前已有研究致力于采用红色或近红外报告分子以增加光的穿透深度。
荧光成像的另一个优势在于，如果特定的荧光报告分子获得用于人体的批准，该技术可直接转化应用于临床。与磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和正电子发射断层扫描（PET）相比，荧光成像具有更高的灵活性，因为它不需要昂贵的硬件设备和成像试剂。一个典型的例子是基于荧光的内窥镜和微内窥镜，这些设备已在临床中得到应用。通过将荧光成像与其他成像模式相结合，我们有望同时获取有关基础生物学过程的解剖和功能信息。
致谢
杨Z和王Y的研究工作得到了NIAMS/NIH资助K02 AR051181、肌萎缩症协会以及哈佛干细胞研究所对王Y的资助支持。曾Q和徐X的研究工作得到了布里格姆妇女医院光学成像实验室获得的项目资助支持。作者感谢布里格姆妇女医院麻醉科刘W在细胞实验技术方面的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | 贝托克技术公司 |
参考文献
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