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试剂的制备
配制PIPES缓冲液（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调节pH至6.8）。根据现有方案1,2，将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和葡萄糖分装后于-70°C保存，紫杉醇于-20°C保存。按照供应商提供的说明，将微管蛋白分装后于-70°C保存。
使用光刻技术制备图案化金微电极
- 使用刻划工具或晶圆切割机将硅片切割成 1 cm × 1.5 cm 的基底。将基底放入烧杯中，加入足量丙酮完全浸没，超声清洗 5 分钟。在基底未干燥的情况下，用新鲜丙酮冲洗，随后立即用异丙醇冲洗，并用氮气吹干。
- 根据所需结构尺寸，采用标准正性光刻或电子束光刻技术在洁净的基底上制备金微电极3。设计电极图形时，应使每个电极图形的直径小于 100 微米，以确保后续可被 PEG 自组装单分子层（SAM）完全覆盖（见下节描述）。在距离图形 300 至 500 mm 处设置引线焊盘（约 300 mm2），并通过一条 1 mm 宽的导线将焊盘与电极相连（图 1）。将光刻图形置于基底中央附近，以便在图形周围留出足够空间用于组装流动池。
图 1. 样品几何结构示意图。请点击此处查看图 1 的放大版本。
- 在光刻胶层显影后，用镊子从引线焊盘处刮一条线至基底边缘（图 1）。在金属沉积过程中，该刮痕可使电极与基底边缘实现电连接。使用沉积腔室（建议配备两个蒸发源）进行金属层沉积。依次沉积 2 nm 铬（用于增强附着力）和 6 nm 金，过程中保持真空不中断。腔室内可配备石英晶体微天平，用于实时监测薄膜沉积厚度。
制备 SAM
- 在通风良好的区域将烘箱预热至 75°C。取一个 250 mL 玻璃烧杯，加入 20 mL 甲苯，配制硅烷化溶液。然后使用塑料移液枪向甲苯中加入 1 mL PEG-硅烷（即 5% v/v）。通过上下吹打 5 至 10 次充分混合 PEG-硅烷，再用移液枪搅拌 30 秒。
- 将带有图案的样品放入烧杯中，图案面朝上，确保样品完全浸没在 PEG-硅烷甲苯溶液中，并均匀分布在烧杯底部。将烧杯放入烘箱，在 75°C 下加热 18 至 21 小时。在自组装单分子膜（SAM）形成的同时，制备对电极（见下文），并组装后续步骤所需的其他组件。
- 在烘箱中加热 18–21 小时后，甲苯应已蒸发，样品表面留下黏稠的 PEG-硅烷残留物。向烧杯中加入 20 mL 甲苯，浸泡样品 1–2 分钟。将样品从烧杯中取出，依次用甲苯、异丙醇冲洗，最后用氮气吹干。此时样品应看起来洁净，自组装单分子膜（SAM）层在肉眼观察下不可见。此类 SAM 样品在低温干燥条件（25 °C，中等湿度）下储存时，可在两天内使用。若 SAM 形成失败，则样品表面会残留浑浊或颜色不均的涂层。
制备对电极
在用于微电极沉积的同一沉积腔室装置中，通过在22 × 50 mm的1号或0号玻璃盖玻片上先沉积1 nm铬（Cr），再沉积4 nm金（Au），制备对电极。对电极应近乎透明，呈浅灰色或淡粉色。将对电极镀层面向上放置于培养皿中保存，以保持清洁。
将微管蛋白聚合形成微管
- 解冻未标记的微管蛋白和罗丹明标记的微管蛋白，立即按1:2的标记与未标记比例混合，以获得荧光明亮的微管（MTs）。通过反复吹吸数次混匀。将微管蛋白在37°C水浴中聚合20–40分钟。聚合时间越长，微管长度越长。在微管蛋白聚合的同时，向含有PIPES缓冲液的微量离心管中加入紫杉醇至终浓度为20 mM，配制PIPES-紫杉醇缓冲液。通过反复吹吸并涡旋充分混匀紫杉醇，随后将离心管置于37°C水浴中预热。聚合完成后，用预热的PIPES-紫杉醇缓冲液将微管稀释100倍，并避光保存。以此方法制备的微管会随时间延长而继续伸长并发生束化，可通过进一步稀释减轻该现象。
- 通过混合30 mL冷的PIPES缓冲液（0–4°C）、5 mL 50% 2-巯基乙醇、5 mL葡萄糖氧化酶、5 mL过氧化氢酶和5 mL葡萄糖，配制10倍浓缩的氧气清除混合液（OS）。2 葡萄糖应最后加入。每次添加组分后，通过移液器上下吹打3-5次混匀。将OS混合液置于冰上，其活性可保持约2小时。
- 通过使用1x OS混合液对制备的微管（MT）进行成像，验证微管聚合是否成功，并确认微管在数分钟荧光激发下保持稳定。对以该方法制备的微管进行成像时，务必选用适用于罗丹明荧光的激发/发射滤光片组合。为进一步确定适合成像单个微管丝的最优工作稀释度，可使用PIPES缓冲液将微管样品稀释1/10至1/100，再与1x OS混合液共同孵育后进行成像。
- 通过将两条双面胶带（相距2-3 mm）夹在一大（22 × 50 mm）一小（22 × 22 mm）玻璃盖玻片之间，制备一个流动小室。可将双面胶带贴于载玻片上，用剃刀片切割成条状，便于操作。使用微量移液器向流动小室内加入数微升微管（MTs）。对于高倍成像，可能需要使用长工作距离物镜来观察流动小室的上表面。从盖玻片/样品表面到流动小室上表面的距离由胶带厚度决定，应为60–100 μm。
利用电泳技术对微管进行图案化
- 通过在图案化的 SAM 涂层样品上放置两条双面胶带，制备电泳装置，使电极位于胶带之间，且连接路径与胶带垂直（图 2）。将对电极放置在双面胶带上，金属面接触胶带，使样品边缘约有 3 mm 伸出对电极之外（图 2）。剪取数段 15 cm 长的绝缘铜漆包线，并将两端各剥去 1 cm 绝缘层。使用少量银浆将一根导线连接至基底暴露的 Au 区域，注意避免与对电极形成电接触（可用万用表检测）。用银浆将第二根导线连接至对电极。用银浆固定的导线可用胶带进一步固定在样品上。
图 2. 倒置荧光显微镜用流动池组装示意图。请点击此处查看图 2 的放大版本。
- 使用 PIPES 缓冲液将微管（MTs）稀释至所需浓度，并加入终浓度为 1x 的 OS。以 20X 放大倍数成像，在施加电压前定位硅片上的图案。可选步骤：可用指甲油密封流动室，以防止液体流动及微管在流动室平面内的迁移。
- 施加最高达 1 V 的电压，并观察微管的迁移行为。若需实现微管的可逆捕获，可使用较低电压（低至约 0.5 V），但此时需密封流动室以防止横向漂移。指甲油可有效密封流动室的开放端。当电压高于约 0.7 V 时，可在图案区域观察到部分微管粘附，但粘附较弱；当电压高于约 0.9 V 时，微管迁移速度加快，粘附也更强。当电压超过约 1.2 V 时，发生电解（产生气泡）以及微电极损坏的可能性显著增加。可通过调节显微镜的焦平面来追踪微管的迁移过程。若操作正确，微管将定位于电极表面。
