我们介绍一种在带有金微电极的硅基底上形成聚乙二醇自组装单分子层（PEG-SAM）的方法。该PEG-SAM通过一步法形成，可防止硅和金表面的生物污染。随后利用电泳技术实现生物分子在纳米尺度上的图案化。
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本文内容
摘要
摘要
我们介绍一种在带有金微电极的硅基底上形成聚乙二醇三甲氧基硅烷（PEG-trimethoxysilane）自组装单分子层（SAM）的方法。该PEG-SAM通过一步组装形成，可有效防止硅和金表面的生物污染。该SAM可用于涂覆采用标准正性光刻工艺制备的微电极。以微管为例，我们施加直流电压，可逆地诱导微管通过电泳迁移至SAM包被的电极。实验中使用流动腔室对电泳迁移过程及微管的图案化进行成像观察。in situ使用落射荧光显微镜。该方法通常适用于生物分子的图案化，因为它利用电泳将目标分子固定，因而无需特定的分子相互作用。此外，该方法避免了直接使用光刻技术对自组装单分子层（SAM）分子进行图案化时所遇到的问题。与电子束光刻的兼容性使得该方法可用于纳米尺度的生物分子图案化。
方案
试剂的制备
配制 PIPES 缓冲液（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用 KOH 调至 pH 6.8）。根据现有方案1,2，将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和葡萄糖分装后于 -70°C 保存，紫杉醇于 -20°C 保存。根据供应商提供的说明，将微管蛋白分装后于 -70°C 保存。
使用光刻技术制备图案化金微电极
- 使用刻划笔或晶圆切割器将硅片切割成 1 cm ´ 1.5 cm 的基底。将基底放入盛有足量丙酮的烧杯中，超声清洗 5 分钟。在基底未干燥的情况下，用新鲜丙酮冲洗，随后立即用异丙醇冲洗，并用氮气吹干。
- 根据所需结构尺寸，采用标准的正性光刻或电子束光刻技术在洁净的基底上制备金微电极3。设计图案几何形状时，应使每个电极图案的直径小于 100 微米，以确保能被后续的 PEG 自组装单分子层（SAM）完全覆盖（见下一节描述）。在距离图案 300 至 500 mm 处设置引线焊盘（约 300 mm2），并通过一条 1 mm 宽的导线将焊盘与电极相连（图 1）。将光刻图案置于基底中央附近，以便在图案周围留出空间用于组装流动池。
图 1. 样品几何结构示意图。请点击此处查看图 1 的放大版本。 - 在光刻胶层中完成图案显影后，使用镊子从引线焊盘处沿基底边缘刮划一条线（图 1）。在金属沉积过程中，该刮痕可使电极与基底边缘之间形成电连接。使用沉积腔室（优选配备双源）进行金属层沉积。依次沉积 2 nm 铬（用于增强附着力）和 6 nm 金，过程中保持真空不中断。腔室内配备的石英晶体微天平可用于实时监测薄膜沉积厚度。
制备 SAM
- 在通风良好的环境中将烘箱预热至 75°C。取一个 250 mL 玻璃烧杯，加入 20 mL 甲苯，配制硅烷化溶液。然后使用塑料移液管向甲苯中加入 1 mL PEG-硅烷（即 5% v/v）。用移液管反复吹打 5 至 10 次，使 PEG-硅烷充分混匀，再用移液管搅拌 30 秒。
- 将带有图案的样品放入烧杯中，图案面朝上，确保样品完全浸没在 PEG-硅烷甲苯溶液中，并在烧杯底部均匀分布。将烧杯放入烘箱，在 75°C 下烘烤 18 至 21 小时。在自组装单分子膜（SAM）形成期间，准备对电极（见下文），并组装后续步骤所需的其他组件。
- 烘烤 18 至 21 小时后，甲苯应已蒸发，样品表面留下黏稠的 PEG-硅烷残留物。向烧杯中加入 20 mL 甲苯，浸泡样品 1 至 2 分钟。将样品从烧杯中取出，依次用甲苯、异丙醇冲洗，最后用氮气吹干。此时样品应看起来洁净，自组装单分子膜（SAM）层在肉眼观察下不可见。此类 SAM 样品在低温干燥条件下（25 °C，中等湿度）最多可保存两天。若 SAM 形成失败，则样品表面会呈现浑浊或颜色不均的残留涂层。
制备对电极
在用于微电极沉积的同一沉积腔室装置中，通过在22 × 50 mm的1号或0号玻璃盖玻片上先沉积1 nm的Cr，再沉积4 nm的Au，制备对电极。对电极应近乎透明，呈浅灰色或淡粉色。将对电极镀层面朝上存放于培养皿中以保持清洁。
将微管蛋白聚合形成微管
- 解冻未标记的微管蛋白和罗丹明标记的微管蛋白，立即按1:2的标记蛋白与未标记蛋白比例混合，以获得荧光强烈的微管。用移液器吹打数次混匀。将微管蛋白在预热的水浴中孵育20–40分钟以诱导聚合 37°C微管的长度会随着聚合时间的延长而增加。在微管蛋白聚合的同时，通过将紫杉醇加入含有PIPES缓冲液的微量离心管中，配制含20 mM紫杉醇的PIPES-紫杉醇缓冲液。用移液器反复吹打并涡旋充分混匀紫杉醇，然后将离心管置于预热的水浴中 37°C聚合完成后，用温热的PIPES-紫杉醇缓冲液将微管（MTs）稀释1/100，并避光保存。以此方法制备的微管会随时间逐渐延长并发生束化，进一步稀释可减轻该现象。
- 通过将30 mL 冷的PIPES缓冲液（0-4°C5 mL 50% 2-巯基乙醇，5 mL 葡萄糖氧化酶，5 mL 过氧化氢酶，和 5 mL 葡萄糖。2 葡萄糖应最后加入。每加入一种成分后，用移液器上下吹打3-5次混匀。将OS混合液置于冰上，其活性可保持约2小时。
- 通过使用1×OS缓冲液对制备的微管（MT）进行成像，验证微管聚合是否成功，并确认微管在数分钟荧光激发下保持稳定。对以该方法制备的微管进行成像时，务必选用适用于罗丹明荧光的激发/发射滤光片组合。为进一步确定用于成像单根微丝的最佳工作稀释度，可使用PIPES缓冲液将微管稀释1/10至1/100，并在1×OS缓冲液存在下进行成像。
- 通过将两段双面胶带（相距2-3 mm）夹在一大（22 × 50 mm）一小（22 × 22 mm）玻璃盖玻片之间，制备一个流动小室。可将双面胶带贴于载玻片上，用剃刀片切割成条状，便于操作。使用移液器向流动小室内引入数微升微管蛋白（MTs）。对于高倍成像，可能需要使用长工作距离物镜来观察流动小室的上表面。从盖玻片/样品表面到流动小室上表面的距离由胶带厚度决定，应为60-100 mm。
利用电泳技术对微管进行图案化
- 通过在图案化的 SAM 涂层样品上放置两条双面胶带，准备电泳装置，使电极位于胶带之间，且连接路径与胶带垂直（图 2）。将对电极放置在双面胶带上，金属面接触胶带，使样品边缘在对电极上悬空约 3 mm（图 2）。剪下数段 15 cm 长的绝缘铜漆包线，并将两端各剥去 1 cm 的绝缘层。使用少量银浆将一根导线连接到基底暴露的 Au 区域，注意避免与对电极形成电接触（可用万用表检测）。使用银浆将第二根导线连接到对电极上。用银浆连接的导线可用胶带进一步固定在样品上。
图 2. 倒置荧光显微镜用流动池组装示意图。请 点击此处 查看图 2 的放大版本。 - 使用 PIPES 缓冲液将微管蛋白（MTs）稀释至所需浓度，并加入 OS 至终浓度为 1×。以 20 倍放大倍数成像，并在施加电压前定位硅晶圆上的图案。可选地，可使用指甲油密封流动室，以防止流体流动和微管蛋白在流动室平面内的迁移。
- 施加最高达 1 V 的电压，并观察微管蛋白的迁移。若需实现微管蛋白的可逆捕获，可使用较低电压（低至约 0.5 V），但需密封流动室以防止横向漂移。指甲油适用于密封流动室的开放端。当电压高于约 0.7 V 时，可在图案上观察到部分微管蛋白粘附，但粘附较弱。当电压高于约 0.9 V 时，微管蛋白迁移速度加快，粘附也更强。当电压超过约 1.2 V 时，发生电解（气泡形成）以及微电极损坏的可能性显著增加。可通过调节显微镜的焦平面来追踪迁移过程。若操作正确，微管蛋白将定位于电极表面。
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讨论
由于微管（MTs）具有高亮度且背景荧光低，其迁移过程可通过荧光显微镜轻松观察。该方法通常适用于生物分子的图案化，仅需通过适当调节缓冲液pH值使生物分子带有净电荷即可。本实验装置中避免了电渗现象，因为不存在诸如毛细管电泳中使用的带电硅壁等带电表面。
该方法有多种可能的改进方式。密封流动室的两端对于观察可逆性至关重要，因为开放端的蒸发会导致体相液体流动和微管的非预期迁移。在光刻图形化之前对硅片进行氧化处理，可以阻止基底导电，从而允许同时使用具有独立电位的多个电极。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Melissa Grunlan 在自组装单分子膜（SAM）形成方面的有益讨论。本研究部分得到了罗伯特·A·韦尔奇基金会（A-1585）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-[甲氧基聚(乙二醇)丙基]三甲氧基硅烷（PEG-硅烷） | Gelest 公司 | SIM6492.7 | 6-9 个 PEG 单元；分子量 450-600 g/mol-1 |
| 2-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 丙酮 | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS 级 |
| 过氧化氢酶 | Calbiochem | 219001-5MU | |
| 氯苯 | EMD Millipore | MK441908 | ACS级 |
| 乙二醇双(2-氨基–thylether)-N,N,N’，N’-四乙酸（EGTA） | Calbiochem | 324626 | |
| 葡萄糖 | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| 葡萄糖氧化酶 | MP Biomedicals | 100330 | |
| 鸟苷-5’-[(α,Β)-亚甲基]三磷酸钠盐（GMPCPP） | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| 鸟苷-5’-三磷酸 | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| 异丙醇 | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS级 |
| 甲基异丁基酮（MIBK） | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| 紫杉醇（taxol） | Calbiochem | 580555 | |
| 哌嗪-N,N’’-二(2-乙烷磺酸)（PIPES） | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA） | Brewer Science, Inc. | 950K | 分子量 950K |
| 罗丹明标记的微管蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | T331M | 来自牛脑，99%纯度，冻干粉 |
| 甲苯 | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS级 |
| 微管蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | T238 | 来自牛脑，99% 纯度，冻干粉 |
No. 1 硼硅酸盐玻璃盖玻片（22 × 50 mm）购自 VWR。抛光电子级 p 型 <111> 硅片购自Addison Engineering, Inc.。高纯度银漆购自Structure Probe, Inc.（目录号 # 5001 AB）。绝缘细径铜漆包线（~ 0.08 mm（0.003”）直径）可从电子器材供应商处获得。 |
参考文献
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
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重印与许可
