这是一种用于斑马鱼的高通量精子冷冻保存方案。采用该方案冷冻保存的精子在后续体外受精中平均具有25%的受精率，并可在多年内保持稳定。
本文内容
摘要
摘要
这是一种对哈维法（Harvey et al., 1982）进行改良的斑马鱼精子冷冻保存方法。我们对原始方案进行了两项改进，既简化了操作流程，又提高了样品的一致性。第一，我们使用不含冷冻保护剂的冷冻稀释液对所有精子样本的体积进行标准化处理。第二，将冷冻保存的精子储存在冻存管中，而非毛细玻璃管中。精子的冷冻速率和解冻速率（δ°C/时间）可能是本实验中需要控制的两个最关键的变量。因此，请勿使用未指定的其他类型冻存管替代。以两人小组协作的方式操作，每组可在约2小时内完成100尾雄鱼精子的冷冻保存。采用本方案冷冻保存的精子平均受精率约为25%（通过体外受精后产生的可存活胚胎数除以受精的卵子总数来衡量），且该受精率在多年内保持稳定。
斑马鱼，精子冷冻保存，体外受精，冷冻保护剂，冻存管，冷冻速率，解冻速率
方案
A 部分：精子冷冻溶液
1. 吉恩斯伯格鱼林格氏液（每3天新鲜配制；Ginsburg, 1963）
注意：添加顺序至关重要，以防沉淀产生
在 450 ml 无菌 ddH2O 中溶解：
- NaCl 3.25 g
- KCl 0.125 g
- CaCl2•2 H2O 0.175 g
然后加入： - NaHCO3 0.10 g
用无菌 ddH2O 定容至 500 ml，并在 4°C 下保存。
2. 冻存液（每日新鲜配制）
- 不含甲醇
- 吉恩斯堡鱼类林格氏液 10 ml（室温）
- 脱脂奶粉粉末 1.5 g
- 含甲醇
注意：添加顺序至关重要，以防止沉淀产生
- 吉恩斯堡鱼类林格氏液 9 ml（室温）
- 甲醇 1 ml
- 脱脂奶粉粉末 1.5 g
配制冻存培养基后，于摇床或振荡器上充分混匀 20 分钟。使用前分装至 1 ml 离心管中，避免产生表面气泡。
B 部分：精子冷冻所需材料
精子冷冻所需材料
- 10 μl 一次性移液管（Fisherbrand 货号# 22-358697）
- 用于盛放含 MESAB/Tricaine 鱼类养殖水的 250 ml 烧杯
- 表面皿（Pyrex 货号# 9985-75）
- P20 移液器（或同等产品）及吸头
- 海绵鱼夹持器（用于夹持雄鱼以便挤压）
- 配备载物台上方照明的解剖显微镜
- 扁头镊子（例如 Millipore 型）
- 2.0 ml 冻存管（Corning 目录号 430488）
- 10×10 冻存盒（Nalgene 货号 03-337-7AA）
- 泡沫塑料容器，装有约 15 cm 厚的细碎干冰1
- 15 ml 圆锥形离心管（Falcon # 352099）
- 装有液氮的杜瓦瓶
- 长柄镊子（例如 CMS Fisher Health Care 货号# 10-316B）
- 冷冻手套
- 雄性恢复箱
- 一个不含甲醇的冻存液离心管
- 一个装有含甲醇冷冻介质的离心管
- 超低温冰箱（例如 Taylor-Warton K系列）
1 制备细碎干冰的一种简单方法是将干冰用毛巾包裹后，用锤子将其粉碎。更高效的方法是使用干冰研磨机，例如 Clawson 型号 RE-2。
C 部分：精子冷冻方法
- 标记毛细管： 实验开始前，使用实验记号笔在10μl毛细管上标记3.33 μl刻度位置（即从底部起16.7 mm处；见图1.1）。
- 麻醉雄鱼： 将雄鱼放入含有MESAB/三卡因（tricaine）稀释于鱼用水中的烧杯中（配方见《斑马鱼手册》）。
- 擦干鱼体： 麻醉后，用塑料勺将鱼从麻醉液中取出，并用纸巾轻轻吸干鱼体表面水分，特别注意腹部区域的干燥。水会激活精子，因此必须彻底擦干泄殖腔周围区域。将鱼腹面朝上置于海绵支架上（图1.2）。若肛鳍周围区域仍潮湿，可用无尘纸（kimwipe）轻轻擦干。注意切勿过早挤压导致精子排出！
- 将已标记的毛细管插入毛细管配套的橡胶口吸管接头中。该接头为一端带吹嘴、另一端为毛细管固定装置的橡胶管。或者，也可将毛细管通过一段适当直径的泰龙（tygon）软管连接至50μl Hamilton注射器。
- 将雄鱼置于显微镜下，用毛细管末端小心分开腹鳍，暴露泌尿生殖孔。
- 收集精子： 用光滑镊子（如Millipore品牌）轻轻夹压鱼体两侧，或用拇指与食指轻轻挤压鱼体两侧，使精子排出。用轻微负压将排出的精子吸入毛细管中（图1.2）。注意避免混入可能随精子排出的粪便。
- 将精子体积标准化至3.3 μl： 若毛细管中精子体积达到或超过标记线（即16.7 mm或以上），则进入第8步。若精子体积未达目标刻度，则使用不含甲醇的冷冻保护液（Freeze Medium）补足至标记线处（图1.3）。可接受的最小精子量取决于精子质量。优质精子呈白色不透明状；劣质精子则呈水样。通常，我们接受的最低标准为：优质精子1 μl（即目标体积的1/3），劣质精子2 μl（即目标体积的2/3）。此时精子体积已标准化为3.3 μl。
- 向精子中加入冷冻保护剂： 吸取含甲醇的冷冻保护液（Freezing Medium）至毛细管橙色标记处（总体积约为20 μl；图1.4）。将精子与冷冻保护剂混合液轻轻排出至表面洁净的表玻璃上，注意避免引入气泡。通过上下吹打约4次轻轻混匀（避免产生气泡）。
- 将10μl精子分装至两个冻存管中： 用移液器将10 μl精子-冷冻保护剂混合液分别加入两个已标记相关信息的冻存管底部（图1.5）。操作需迅速，立即盖紧管盖，并将冻存管分别投入室温的15 ml Falcon管底部——每管一个冻存管。盖紧Falcon管盖，将装有冻存管的Falcon管对插入粉碎状干冰中。
- 在干冰上冷冻精子20分钟： 干冰应呈细粉状，而非颗粒状。Falcon管应插入干冰足够深度，仅露出管盖（图1.6）。为便于追踪干冰中的样品管，可为每对Falcon管编号（1-20，写于管盖上），并记录其放入干冰的时间。
- 将冻存管转移至液氮中： 精子在干冰上冷冻20分钟后，将其转移至盛有液氮的杜瓦瓶中。精子在此暂存，待后续转入液氮超低温冰箱。在将样品放入冻存盒时，应先将冻存盒置于液氮浴中，防止样品升温。使用长金属镊子从杜瓦瓶中取出冻存管，并佩戴防冻手套操作。或者，若将冻存盒始终保持浸没于泡沫箱内的液氮中，也可直接将冻存管从干冰转移至冻存盒。
- 将冻存管长期保存于液氮超低温冰箱中。为维持精子活力，冻存管必须完全浸没于液氮中保存。根据我们的经验，若仅保存于气相液氮中，精子活力会随时间下降。
操作速度至关重要！ 从加入冷冻保护剂到将精子冻存管放入干冰之间的时间（即步骤6-10）不应超过30秒。
第 D 部分：使用冷冻保存精子的体外受精方法
我们发现由两人配合操作效果最佳。一人负责从雌性个体中挤出卵子，另一人负责解冻精子。
- 将水浴锅设置为 33°C。
- 从液氮冻存罐中取出冻存管，并转移至盛有液氮的杜瓦瓶中，待解冻时使用。
- 将雌鱼的卵挤入 35 mm 塑料培养皿中。尽可能获取 3 批卵块并合并至同一培养皿中。若在获得第一批卵块后的 1 分钟内无法再获得另外两批优质卵块，则进入步骤 4（一批优质卵块已足够）。优质卵块的定义：含有 >150 个外观均匀良好的卵（呈淡黄色，无白色碎片等降解迹象）。在精子解冻期间保持培养皿加盖。
- 从液氮中取出冻存管，拧开管盖。迅速将冻存管下半部分浸入 33°C 水浴中，持续 8–10 秒。
- 立即向管中加入 70 μl 室温的 Hank's 溶液，用移液器吹打混匀。随后迅速将混合液加入卵中，并用移液器枪头轻轻混匀。
- 立即加入 750 μl 鱼用水以激活精子和卵子，轻轻旋转混匀。于室温下孵育 5 分钟。
- 5 分钟后，用鱼用水加满培养皿，并将培养皿置于 28°C 条件下孵育。2–3 小时后，统计受精胚胎数量，并将其转移至 100 mm 培养皿中（每皿 50 个）。同时统计未受精卵数量，以便计算受精率。
- 妥善照料幼鱼！前 5 天每天更换水并清除死亡胚胎。在第 5 天仅将已发育出 swim bladder（鳔）的幼鱼转入育苗池。
第五部分：代表性结果
我们采用该冷冻保存方法，在2001年至2003年间建立了包含8600份冻存精子样本的TILLING文库。我们已解冻其中106份样本，并测定了其受精能力。受精能力是指体外受精后产生的可存活胚胎数与使用冻存精子受精的卵子总数之比。新鲜（未经冷冻保存）的精子通常具有 >95% 受精率；冷冻保存的精子受精率显著降低：平均为 29%（n=106 管）。各冻存管之间的受精率差异较大，范围从低于 1% 到高达 62%。这一变异性在图 2 中以标准差的大误差线表示。然而，在迄今解冻的 106 份精子样品中，仅有一例出现两份精子样品受精率均为 0%，并导致未能回收相应的 TILLING 突变。
通过在多年间（2001–2008年）陆续解冻我们文库中的精子冻存管，我们发现采用该方法冷冻的精子样本，其平均受精率随时间推移保持稳定（图2）。2001年解冻的冷冻精子样本平均受精率为23.5%（基于11个精子样本），2008年解冻的样本平均受精率为25%（基于21个精子样本）。
目前，其他一些研究人员也正在其实验室中使用该精子冷冻方案。部分人报告称，受精率以及样本间变异程度与我们观察到的结果相似，效果良好。但据称也有部分人未能成功应用该方案。我们认为，可能的问题来源包括：
- 未使用本方案中推荐的特定冻存管或锥形管，导致在干冰中冷却速率不同；
- 未使用粉末状干冰，导致冷却速率不理想；
- 使用生育力差的雄鱼：单条雄鱼应至少获得 1 μl 精液。也可通过新鲜精液进行体外受精来检测雄鱼生育力，但此方法可能具有误导性，因为极少量的新鲜精液即可达到接近 100% 的受精率；
- 在体外受精中使用质量低劣的卵子。若未使用完全正常的卵团，即使来自实际具有较好生育力的精子样本（基于重复冻存管的受精率），也会导致接近 0% 的受精率。
图1. 精子冷冻方法示意图。
图2. 冷冻保存的精子生育力随时间保持稳定。生育率百分比是指体外受精中产生的可存活胚胎数量除以用冷冻精子受精的卵子总数。"n" 表示在相应年份中检测生育力的冷冻精子冻存管数量。误差线代表标准差。由于每支精子冻存管来自不同的雄性个体，因此观察到不同冻存管之间的变异性。
讨论
目前，其他一些研究人员也正在其实验室中使用该精子冷冻方案。部分研究人员报告称获得了相似的受精率，以及与我们观察到的类似的样本间变异。据称，也有研究人员未能使其在实验中成功应用该方案。我们认为，可能的问题来源包括：
- 未使用本方案中推荐的特定冻存管或锥形管，可能导致在干冰中冷却速率不同；
- 未使用粉末状干冰，导致冷却速率次优；
- 使用生育力差的雄鱼：单条雄鱼应至少获得 1 μl 精液。也可通过新鲜精液进行体外受精来检测雄鱼生育力，但该方法可能具有误导性，因为极少量的新鲜精液即可实现接近 100% 的受精率。体型较大、体色更鲜艳的雄鱼通常能提供更高质量的精液。
- 在体外受精中使用质量不达标的卵子。若未使用完全正常的卵团，即使精液样本本身具有良好的生育力（基于重复冻存管的受精结果），也会导致受精率接近 0%。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 HG002995 项目“斑马鱼基因组的TILLING：一种反向遗传学方法”资助，项目负责人为CBM。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 μl 一次性移液管 | Fisher Scientific | 22-358697 | |
| 表面皿 | Pyrex | 9985-75 | |
| 2 ml 冻存管 | Corning | 430488 | |
| 10 x 10 冻存盒 | Nalge Nunc international | 03-337-7AA | |
| 15 ml 锥形离心管 | Falcon BD | 352099 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 10-316B | |
| 深低温冰箱 | Taylor-Wharton | K-series | 例如 |
参考文献
- Ginsburg, A. S. Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).
重印与许可
