对于斑马鱼精子超低温冷冻保存的一个高通量的方法和施肥

摘要

这是一种高通量的精子冷冻保存对斑马鱼的协议。精子冷冻保存，使用此协议，有25％在随后的体外受精生育的平均多年来保持稳定。

摘要

这是一个斑马鱼的精子冷冻保存方法，是一种适应哈维方法（哈维等人，1982年）。我们引进了两个转变到原来的协议，既简化程序，提高样品的均匀性。首先，我们所有精子量，使用不包含的冷冻保护剂的冻结媒体正常化。二，精子冷冻保存，储存在离心管代替毛细管。精子的冷冻和解冻（δ° C /时间）的利率可能控制在此过程中最关键的两个变量。出于这个原因，不代替指定的那些不同的管子。 2，团队的工作是可能的，冻结100〜2小时，每队男性的精子。精子冷冻保存，使用此协议，有25％的平均生育率（除以总数的受精卵在体外授精产生可行的胚胎数量来衡量），多年来，这个百分比生育率稳定。

方案

A部分:精子冷冻解决方案

1。金斯伯格鱼林格（做出新的，每3天;金斯伯格，1963年）

注:添加顺序重要的是要防止沉淀

在450毫升无菌ddH2O溶解:

• 氯化钠3.25克
• 氯化钾0.125克
• 氯化钙•2水0.175克
  然后添加:
• 碳酸氢钠每股面值0.10克

使终体积为500毫升无菌ddH2O和储存在4 ° C

2。冻存液（请每日新鲜）

1. 无甲醇
   • 金斯伯格鱼林格10毫升（室温）。
   • 脱脂奶粉1.5 GM
2. 用甲醇
   
   注:添加顺序重要的是要防止沉淀
   
   
   • 金斯伯格鱼林格9毫升（室温）
   • 甲醇1毫升
   • 脱脂奶粉1.5克
   
   组装后冻结的媒体，拌匀20分钟。轨道摇床或摇杆。在使用之前，分装成1毫升的Eppendorf管中，避免表面气泡。
   

B部分:精子冷冻所需的材料

精子冷冻所需的材料

1. 一次性移液器10μL（Fisherbrand CAT＃22-358697）
2. 鱼水250毫升的烧杯中包含MESAB / Tricaine
3. 钟表眼镜（耐热猫＃9985-75）
4. P20的pipetman（或同等学历）和提示
5. 海绵鱼持有人（持有男性，而挤压）
6. 以上舞台灯光与解剖显微镜
7. 扁钳（如微孔型）
8. 2.0毫升低温瓶（康宁猫＃430488）
9. 10X10 cryoboxes（猫NALGENE＃03 - 337 - 7AA）
10. 发泡胶容器充满〜15厘米，细粉碎的干ICE1
11. 15 ml锥形管（猎鹰＃352099）
12. 含有液氮的杜瓦瓶
13. 长钳（如CMS费舍尔保健猫＃10 - 316B）
14. Cryogloves
15. 男性的回收罐
16. 一个Eppendorf管中充满冻结无甲醇媒体
17. 一个Eppendorf管中充满冻结媒体用甲醇
18. Cryofreezer（如泰勒 - 沃顿K系列）

¹一个简单的方法是制作精细粉碎的干冰包裹在毛巾和粉碎锤。更有效的方法是使用干冰磨床，如克劳森模型RE - 2。

C部分:精子冷冻法

1. 标记毛细管:开始前，马克与实验室笔的水平为3.33μL加入10μl毛细管（即16.7毫米，从底部，见图1.1） 。
2. 男:麻醉包含MESAB / tricaine鱼水稀释（配方"的斑马鱼书"）进行烧杯中的男性（S ）
3. 干鱼:麻醉后，解除鱼的麻醉剂使用塑料勺轻轻吸干鱼纸巾上晾干，要特别注意干燥的腹侧方。水激活精子，因此重要的是彻底干燥泄殖腔周围。位置鱼海绵持有人，腹的一面向上（图1.2）。如果臀鳍周围地区仍是湿润，轻轻地用kimwipe干。小心，不要挤精子过早！
4. 放置标记在橡胶口吸管适配器，包括毛细管毛细管。适配器是橡胶软管，有一端的喉舌和毛细血管上的其他持有人。另外，毛细管，可以连接到一个汉密尔顿50μL注射器通过适当直径的聚乙烯管的一小段。
5. 男下的范围和揭露仔细传播腹鳍，除了使用毛细管年底泌尿生殖系统的开放。
6. 收集精子:驱逐鱼的两侧轻轻地抚摸着顺利钳（如Millipore公司）的精子，或你的食指和拇指之间的鱼的两侧轻轻挤压。在毛细管收集精子，因为它是被驱逐用温和的吸力（图1.2）。避免可能与精子排出的粪便。
7. 正常化精子量为3.3μL:如果精子到达量，或超过毛细管（即16.7毫米或更大）的笔标记，然后继续执行步骤8 。如果精子量没有达到目标量，然后正常化音量笔商标使用无甲醇（图1.3）冻结中等。精子的最低金额是可以接受的，与精子质量的变化。良好的精子是白色的，不透明的。可怜的精子看起来水汪汪的。在一般情况下，我们接受的最小值:1μL良好的精子（或1 / 3的目标）和2μl差的精子（或2 / 3的目标）。卷已归至3.3μL。
8. 地址冷冻保护剂对精子:大吃冻结与M中等乙醇橙色标志（约总体积为20μL;图1.4）。驱逐到了手表的玻璃洁净区精子冷冻保护剂的混合物，要特别注意不要引入气泡。轻轻吹打向上和向下〜4倍（避免引入气泡）混合。
9. 放到各2离心管加入10μl精子:吸取10μL的精子冷冻保护剂的解决方案:到已与相关信息（图1.5）标记的两个单独的离心管底部。快速移动，盖瓶和拖放到室温15毫升猎鹰管一离心管/管底部。第猎鹰管和一双猎鹰含离心管，管插入粉碎的干冰。
10. 冻结精子20分钟。干冰:干冰应在细粉末状，没有颗粒。管插入深度不够，只是帽子秀（图1.6）的干冰。为了保持在干冰管的轨道，给每个一双猎鹰管数量从1-20（上限书面），并记录时间，他们的干冰。
11. 地点，液氮冷冻管后的精子已经在20分钟的干冰冷冻，他们转移到含液氮杜瓦真空瓶。直到放入液态氮冷冻，精子是存储在这里。当放置在冷冻箱，放置在液氮，使样品不升温洗澡冷冻箱。使用长的金属钳，恢复杜瓦真空瓶小瓶和处理cryogloves。此外，离心管，可直接传送到冷冻箱，冷冻箱保持沉浸在泡沫塑料容器液氮干冰。
12. 商店冷冻管长期在低温液态氮冷冻 。为了保持精子活力，重要的是保存在液氮中浸泡小瓶。根据我们的经验，在气相中存储的小瓶随着时间的推移失去生存能力。
    速度是很重要的！加入冷冻保护剂和精子小瓶放置在干冰（即步骤6-10）之间的时间应不超过30秒 。
    

D部分:使用冻存精子体外受精方法

我们发现，这个最好两个人一起工作。一人挤压从女性的卵子，而另一部分人解冻的精子。

1. 设置水浴至33 ° C。
2. 取出离心管从液氮冷冻和转移到液态氮中，直到准备解冻杜瓦真空瓶。
3. 从女性挤入35毫米塑料培养皿的鸡蛋。如果可能，尽量获得3个鸡蛋离合器和合并成一盘。如果你不能得到您的第一个离合器1分钟内的三个好离合器，然后进行到第4步（一个很好的离合器就足够了）。好离合器的定义:> 150均匀漂亮的蛋（即偏黄，没有退化的白色碎片指示）。保持覆盖精子解冻时菜。
4. 从液氮中取出小瓶，并删除第。快速浸入小瓶〜1 / 2到33 ° C为8-10秒水浴方式。
5. 快速添加70μL房间温度汉克斯吹打向上和向下的小瓶和混合。立即加入鸡蛋和枪头轻轻混匀。
6. 毫不拖延地加入750μL鱼水，激活精子和卵子。涡流来混合。在室温下孵育5分钟。
7. 5分钟后，填写鱼水和孵化盘菜在28 ° C。 2-3小时后，计数和肥沃的胚胎转移到（50/dish）百毫米菜。不孕鸡蛋计数，使施肥频率可确定。
8. 幼虫以照顾好！第5天，每天换水，并去除死胚胎。只放幼虫已进入第5天育苗鱼鳔。

E部分:代表结果

我们用这种crypreservation方法，以弥补2001年和2003年之间的园艺8600冷冻精子样本库。我们已经解冻这些样品106个，并确定他们的生育能力。生育率是可行的胚胎在体外与冷冻精子受精的卵子的总数除以在施肥的比例。新鲜（非cryporeserved）精子通常> 95％的生育能力;冻存精子的生育率低得多:平均29％（N = 106瓶）。生育率的小瓶，小瓶变异大，范围从不到1％到高达62％的高。这种变异是代表图的标准差较大的误差酒吧。 2。然而，在106个样本的精子解冻日期只有一次，我们有经验丰富的0％生育两个精子样本，未能收回相应的TILLING突变。

从我们在过去的几年中库解冻精子小瓶（2001-2008），我们发现，通过这种方法冷冻精子样本的平均生育率仍随着时间的推移，稳定（图2）。在2001年的冷冻精子解冻样品的平均生育率为23.5％（基于11个精子样本），并于2008年为25％（基于21个精子样本）。

其他一些调查，现在使用这个精子冷冻协议，在他们的实验室。有些报道与生育率和类似我们所观察到的样品，样本变异良好的成功。据报道，其他未能使本议定书的工作在自己手中。我们认为，可能的来源的问题:

1. 未使用的确切的离心管或锥形管，我们已经在协议的建议，导致一个不同的速率在干冰冷却;
2. 不使用粉末状干冰，导致次优的冷却速度;
3. 使用差生育雄性鱼:你应该从一个单一的男性至少有1μL精子。还可以测试男性生育能力与新鲜精子体外授精，但是这可能会造成误导，因为它需要很少的新鲜精子得到接近100％生育。
4. 使用不合标准的优质卵子在体外受精。使用任何东西，但完美的离合器总是导致生育率接近0％水平，即使是从精子样本，具有良好的生育能力（重复小瓶的生育率为基础）。

图1。精子冷冻方法的示意图。

图2。冻存精子生育仍然随着时间的推移稳定。 ％的生育是可行的胚胎与冷冻精子受精的卵子的总数除以在体外授精产生。 "N"指的冻存精子的小瓶，其生育能力测试是在相应年份数量。误差线表示标准偏差。由于每个从不同的男性的精子小瓶，瓶，小瓶的变异观察。

讨论

其他一些调查，现在使用这个精子冷冻协议，在他们的实验室。有些人报告了类似的生育率和我们所观察到的同一样品，样本变异。据报道，其他未能使本议定书的工作在自己手中。我们认为，可能的来源的问题:

1. 未使用的确切的离心管或锥形管，我们已经在协议的建议，导致一个不同的速率在干冰冷却;
2. 不使用粉末状干冰，导致次优的冷却速度;
3. 使用差生育雄性鱼:你应该从一个单一的男性至少有1μL精子。还可以测试男性生育能力与新鲜精子体外授精，但是这可能会造成误导，因为它需要很少的新鲜精子得到接近100％生育。更大，更有力彩色的男性通常会提供更多更高质量的精子。
4. 使用不合标准的优质卵子在体外受精。使用任何东西，但完美的离合器总是导致生育率接近0％水平，即使是从精子样本，具有良好的生育能力（重复小瓶的生育率为基础）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μl 一次性移液器	Fisher Scientific	22-358697
手表眼镜	Pyrex	9985-75
2 ml 低温小瓶	康宁	430488
10 x 10 冻存盒	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml 锥形管	Falcon BD	352099
钳	Fisher Scientific	10-316B
例如	Taylor-Wharton	K 系列	低温冷冻机