本方法通过使用经紫外线灭活的精子进行受精后立即阻断第二次减数分裂，从而产生雌核发育的二倍体斑马鱼胚胎（即胚胎的全部遗传物质仅来自母本）。由于第一次减数分裂过程中发生了重组，EP胚胎并非完全纯合，但在所有未因重组而与着丝粒分离的位点上均为纯合状态。
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本文内容
摘要
摘要
二倍体真核生物中的杂合性常常使遗传学研究变得繁琐。能够直接从杂合雌性个体产生可存活的纯合二倍体后代的方法，使得在加速的正向遗传筛选中可直接对F1代诱变雌性个体进行有害突变的筛选。Streisinger 等人1,2描述了通过使用紫外线失活的精子激活斑马鱼卵，并利用物理处理（热或压力）抑制第二次减数分裂或第一次合子细胞分裂，从而制备雌核发育（纯合）二倍体斑马鱼的方法。其中，“早期压力”（EP）法可阻断受精后不久发生的减数分裂II。EP法能够产生较高比例的可存活胚胎，这些胚胎可发育为具有生育能力的雄性或雌性成鱼。该方法所获得的胚胎在所有基因位点上均为纯合，除非在减数分裂I期间因重组而与着丝粒分离的位点。在EP窝中，纯合突变的检出率在着丝粒附近位点约为50%，而在端粒附近位点则低于1%。本方法原文引自《斑马鱼手册》。3.
方案
早期压力概述
注意：本实验方案中使用的多种试剂（如三卡因、鱼水和亨氏平衡盐溶液）的配制方法可在线获取，详见《斑马鱼手册》第10章3（http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html）
- 使用经紫外线灭活的精子通过体外受精产生胚胎。
- 立即将受精卵转移至装满卵水的玻璃小瓶（带塑料密封盖）中，液面应与瓶口齐平。用一片薄的乳胶橡胶覆盖瓶口，再将已打孔的瓶盖压紧在乳胶膜上，密封小瓶。
- 将小瓶放入液压机中，在受精后1.4分钟时将压力升至8,000 p.s.i.（注意：许多液压机的刻度显示的是作用于直径2英寸活塞上的压力，读数需换算为p.s.i.）
- 从受精后6分钟开始，在1分钟内逐步释放压力。
详细的早期加压操作步骤
- 实验前一天
- 在傍晚时分，将用于挤精的雄鱼和雌鱼分开。由于雄鱼不提供遗传物质，因此可使用任何成年雄鱼。雌鱼腹部应显得饱满肥大，雄鱼则应呈现黄色且行动敏捷。
- 将雌鱼和雄鱼分别在暂养缸中过夜，以便次日早晨方便取用。
- 实验当天早晨
- 配制Hanks溶液；加入碳酸氢钠。
- 准备实验所需物品并带至养鱼设施：冰桶、Hanks溶液、Tricaine、计时器、收集精子用的离心管。
- 用鱼用养殖水稀释Tricaine。
- 收集精子
- 在冰上准备一个装有Hanks溶液的透明小瓶。每条待挤精的雄鱼约需准备50 μl。
- 每次将3至4条雄鱼浸入Tricaine中进行麻醉。可用塑料勺将其从麻醉液中捞出。
- 用养殖水冲洗，并在纸巾上轻轻吸至“微湿但不滴水”状态（非常重要：水分会激活精子）。
- 将鱼置于泡沫固定架中，在体视显微镜低倍镜下（使用落射照明）操作。用镊子分开骨盆鳍，并将微毛细管置于泄殖腔开口处。
- 用光滑的（Millipore）镊子轻轻但有力地沿鱼体两侧摩擦挤压。
- 当乳白色精液从生殖孔排出时，用微毛细管通过轻柔的负压将其吸入收集。
- 将多条雄鱼的精子汇集于冰冻的Hanks盐溶液中。5–10条雄鱼的精子足以使数百枚卵子受精。在低温Hanks溶液中，精子可在数小时甚至数天内保持高效的受精能力。通过肉眼观察精子浓度，收集至形成浑浊悬液即可。
- 紫外线灭活精子
- 在玻璃培养皿底部铺满冰块。
- 将表面皿置于培养皿内的冰上。
- 使用巴斯德移液管，将试管中的精子转移至表面皿上。确保尽可能多地将精子吸入移液管，避免吸入气泡。同时，在将精子从移液管排出至表面皿时，切勿产生气泡。将精子以薄而均匀的一层铺开于表面皿上。丢弃此移液管。
- 将培养皿放入紫外线交联仪中。
- 开启交联仪照射2分钟。
- 使用一支洁净的移液管，将表面皿上的精子吸出，转移至标记为“UV Sperm”的离心管中，并立即置于冰上。
- 卵子收集与体外受精
- 每次将3至4条雌鱼浸入Tricaine中进行麻醉。
- 用养殖水冲洗，并在纸巾上轻轻吸至"微湿但不滴水"状态。过多水分会导致卵子膨胀，从而阻碍受精。
- 将雌鱼置于35 mm塑料培养皿中，用微湿（非湿润）的手指轻轻但有力地按压其腹部。若雌鱼已准备产卵，卵子将很容易排出。
- 用刮铲收集卵子，并将雌鱼放回水中。优质卵子呈淡黄色半透明状，而滞留在雌鱼体内过久的卵子则呈白色且水样（见下文）。为确保获得优质卵子，应在养鱼设施开灯后的前2小时内完成收集。收集后应覆盖卵子以防止干燥。
- 向卵子中加入30–50 μl紫外线处理后的精子悬液，用移液枪头轻轻搅匀。
- 立即加入约1 ml养殖水并启动计时器。此时开始发育的卵将形成单倍体胚胎。
- 早期加压处理。注意：步骤a至g必须在受精后90秒内完成！
- 在加水激活卵子的瞬间启动计时器。
- 等待片刻，补充更多水，轻轻旋转培养皿使卵子聚集于中央。
- 使用切口并抛光过的巴斯德移液管，将已受精的卵子转移至加压管中。
- 如有需要，向管中补充更多卵子养殖水，直至接近溢出，在管口形成一层水珠。
- 在水珠上覆盖橡胶塞，再将塑料盖拧紧固定。
- 将加压管倒置放入压力缸中，并补充卵子养殖水以填满压力缸。将缸盖牢固旋紧。
- 将压力缸放入压力机中，确保柱塞处于上方位置，施加8,000 lbs/sq. in.的压力。
- 保持压力缸在压力机中，直至受精后6分钟（即实际加压时间为4.5分钟）。
- 在受精后6分钟，将压力缸从压力机中取出，并取出加压管。小心擦干管壁，防止胚胎降温。
- 重置压力缸，并重新注入卵子养殖水。
- 根据需要，向下一组加压管中部分注入卵子养殖水以作准备。
- 对所有批次的卵子重复上述操作。
注意：该圆筒一次最多可容纳 3 支小瓶，因此可考虑将卵子的受精时间推迟几分钟，观察其他已置于三卡因中的雌鱼是否产卵。这样可在同一时间处理更多批次，提高效率。此外，一旦开始使用挤压器，切勿再将更多鱼类放入三卡因中，直至处理完成。鱼类在麻醉剂中停留过久可能导致死亡。其次，若在使用挤压器期间对鱼类进行挤压并获得卵子，这些卵子可能因等待时间过长而变得过于干燥，从而失去活力。
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讨论
必须确保通过该方法产生的胚胎确实是真正的雌核发育二倍体。作为对照，应保留一部分未经紫外线灭活的精子，用于产生一窝正常的二倍体卵；同时保留一窝经紫外线灭活精子受精但未进行挤压处理（EP）的卵，以获得单倍体胚胎。受精后1天，单倍体胚胎表现为体轴较短，脑部和体节形态不规则。单倍体胚胎在2至3天后无法继续存活。挤压处理后的二倍体胚胎应与正常二倍体相似，尽管可能会出现一些形态异常的“EP畸形体”。经挤压处理的二倍体胚胎窝中应有大部分（70–90%）具有存活能力。若在挤压处理的二倍体窝中出现单倍体胚胎，提示挤压处理过程可能失败（例如压力装置未能维持压力）；若在单倍体对照窝中出现二倍体胚胎，则提示精子灭活不完全（例如交联仪操作失败）。
EP 二倍体已被用于确定基因与着丝粒之间的距离1，以定位正向遗传筛选中鉴定出的突变基因4,6。对 EP 二倍体胚胎进行正向筛选是鉴定参与早期及后期发育过程基因的有效方法，目前仍在广泛应用5,7。
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致谢
在20世纪70年代和80年代，查琳·沃克（Charline Walker）在俄勒冈大学乔治·施特赖辛格（George Streisinger）实验室建立了斑马鱼的体外受精和雌核发育二倍体方法。此处描述的方法与查琳的实验方案完全相同，其完整内容可参见《斑马鱼手册》3。
斑马鱼的体外受精和雌核发育二倍体方法由查琳·沃克（Charline Walker）于20世纪70年代和80年代在俄勒冈大学乔治·施特赖辛格（George Streisinger）实验室开发。此处描述的方法与查琳的原始方案完全相同，其完整内容可参见《斑马鱼手册》3。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三卡因 | Sigma-Aldrich | ||
| 表面皿 | |||
| 法国压菌器 | |||
| 加压缸 | |||
| Instant Ocean 海水盐 | |||
| 巴斯德吸管 | 剪去细端，火焰抛光 | ||
| 紫外交联仪 | |||
| 微量毛细管 |
参考文献
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
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