在 Drosophila 中观察跳动的心脏

摘要

介绍了在幼虫和成虫期果蝇（Drosophila）中可视化跳动心脏所需的技术。每个发育阶段都需要采用不同的方法。

摘要

TheDrosophila心脏最近已成为研究肌源性心脏功能背后遗传、细胞和分子机制的一个良好模型系统。在果蝇中研究心脏功能的关键步骤之一，是找到一种能够以保持其肌源性功能的方式暴露心脏，同时仍可观察和记录跳动心脏器官的方法。目前已建立两种不同的方法，用于观察和记录幼虫及成虫的跳动心脏。Drosophila此处描述了我们的方法。使用成年果蝇的半离体 preparation 可以清晰地观察腹部心脏，避免了色素化表皮和覆盖的脂肪体的干扰。为了记录幼虫的心跳，必须固定幼虫，以最小化体壁运动，从而减少与心肌收缩无关的心脏移动。我们的方法可制备出稳定的成虫和幼虫心脏样本，其心跳可持续数小时，频率为 1-3 Hz。

方案

开始之前

成年心脏

1. 现配含108 mM Na的人工血淋巴（AH）溶液⁺，5 mM K⁺，2 mM Ca²⁺²⁺，8 mM MgCl₂，1 mM NaH₂PO₄，4 mM NaHCO₃₃，10 mM 蔗糖，5 mM 海藻糖，5 mM HEPES（pH 7.1，所有试剂均来自 Sigma Chemicals）。蔗糖和海藻糖应在使用前立即从冷藏的储备液中加入AH溶液，以防止细菌污染。
2. 将AH升至室温，并通过通入空气至少15分钟以氧合溶液。
3. 拉取数根细毛细管（例如：Glass Capillaries，100 μl，VWR），用于去除脂肪。

幼虫心脏

1. 硅胶涂层盖玻片：使用牙签将约 50–70 μl 的 Sylgard 溶液转移至 22×22 mm 的盖玻片上。在 65°C 下过夜，使 Sylgard 固化。
2. 配制 Broadie 和 Bate 缓冲液（135 mM NaCl、5 mM KCl、4 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、5 mM TES、36 mM 蔗糖；pH 7.15。参见 Broadie 和 Bate，1993）。
3. 准备用于施加组织胶（Histoacryl）的工具。首先，拉制数根细玻璃毛细管（例如 Science Products GB100T8P）。将一个 1.5 ml 移液器吸头通过小段塑料管（Tygon，1/32 英寸）连接，即将较小的一端插入塑料管中。将毛细管的宽口端插入另一端。通过将毛细管插入胶滴中，并利用塑料吸头进行轻柔抽吸，将 Histoacryl 胶吸入毛细管内。操作胶液时，应另备一根玻璃毛细管，用于清除胶毛细管尖端多余的胶。该胶在接触缓冲盐溶液前保持液态，一旦接触则在数秒内固化。然而，胶通常在足够长的时间内保持可塑性，便于从胶毛细管尖端移除或在施加至样品时进行操作。

成年果蝇的半完整心脏

1. 将成年黑腹果蝇用 Fly Nap（Carolina Biological Supply Co.）麻醉 2-5 分钟。注意不要让果蝇在 Fly Nap 中暴露过久。短期低温处理也可用于麻醉果蝇，但不推荐使用 CO₂，因其对心率和节律性具有更持久的影响。
2. 将麻醉后的果蝇背面向下放置于涂有一层薄薄凡士林的培养皿中。翅膀和身体的疏水性表皮可逆地“粘附”在凡士林上，但必要时仍可重新调整果蝇位置。此步骤在后续操作中尤为重要。
3. 使用弯头弹簧剪刀（Roboz #5611）进行初步切割。将剪刀刀片置于腿部下方，并朝向胸部背侧靠近颈部的位置倾斜。通过一次剪切去除头部、腹神经索和腿部。随后将标本浸入充氧的人工血淋巴（AH）溶液中。
4. 使用弹簧剪刀一次性切除腹部末端（由第7和第8腹节组成）。该操作可为沿腹部两侧边缘进行侧向切开提供通路，并切断后肠与腹部表皮之间的连接。随后移除游离的腹侧腹部表皮瓣。
5. 在步骤 3 和 4 中，已切断肠道的前、后连接，因此腹部器官此时仅由微气管固定在原位。通常可使用珠宝商镊子（Roboz, #55）轻柔牵拉，将肠道及其他腹部器官作为整体移除。清除内脏器官后，可见仍在跳动的心管，其仍附着于背侧表皮，并被脂肪体包围。
6. 脂肪体在光学显微镜下不透明，因此通常需要去除部分脂肪以清晰观察心管。该操作通过使用精细拉制的玻璃毛细管进行“脂肪抽吸”完成。毛细管使用标准拉管仪（例如 Sutter P-97 拉管仪）制备，然后插入塑料管（Tygon，1/16”）并连接至真空源。该系统用于吸除心管周围多余的脂肪组织。吸力大小与毛细管尖端直径成正比，因此不应使用尖端直径大于 40 微米的毛细管。操作时必须极为小心，避免接触心管本身；由于心脏后部极为脆弱，应完全避开该区域。
7. 此时成年黑腹果蝇的心管已暴露，且应处于跳动状态。如有必要，可通过轻轻将表皮从凡士林中提起并小心压回原位的方式重新调整表皮及附着的心管位置，但须始终避免接触心肌组织。此时应更换浸泡标本的溶液为新鲜 AHL。在进行任何操作前，应让标本在持续供氧条件下平衡 20-30 分钟。若需维持标本超过 60 分钟，应持续灌注新鲜 AHL。

固定果蝇幼虫以进行光学记录

1. 在 Sylgard 盖玻片的每个角落附近滴加一滴 Histoacryl 胶水。向胶水滴中加入 50μl B&B 缓冲液，缓冲液会立即使胶水硬化。用 B&B 缓冲液填充胶点之间的空隙——胶水将使缓冲液固定在载玻片上。
2. 取一条游走期 L3 幼虫，将其放置于冰上湿润的滤纸片上 2 分钟，以减缓其活动。随后将幼虫转移至缓冲液中，并使其背面向上（即无刚毛带的一侧朝上）。迅速在幼虫头部区域与 Sylgard 之间施加少量胶水，胶水会快速固化，从而固定幼虫头部，防止其移动。
3. 使用镊子小心夹住幼虫的后端气门，轻轻拉伸幼虫。沿幼虫后半段两侧施加胶水，以将幼虫固定在此拉伸位置。为减少体壁肌肉引起的表皮进一步移动，可在幼虫体侧追加更多胶水。此时幼虫已牢固固定。可将盖玻片置于盛有 AHL 或 PBS 的小型培养皿中。此后可在无体壁运动干扰的情况下记录心脏搏动。

代表性结果：

半切口的成年黑腹果蝇心脏在解剖后若置于新鲜且充氧的AH溶液中，可维持数小时的节律性搏动（参见补充数据，Ocorr 等，2007）。代表性示例见视频1。来自3只^rd 三龄幼虫及年轻果蝇（羽化后1–3周）通常表现出规律的心跳，频率在1–3 Hz之间。羽化超过3周的果蝇通常心律更不规则；然而，这些心脏在含氧的AHL溶液中仍能持续自发搏动数小时。成年果蝇心脏若因解剖操作受损，常出现局部极度收缩且无法松弛的区域。在年龄小于3周的果蝇中，极少观察到心跳频率低于1 Hz的情况；因此，此类样本被视为受损组织，予以弃用。

点击此处下载视频1。——一只一周龄的野生型成年果蝇（w¹¹¹⁸ 实验室品系），显示其暴露的腹部心脏管（左侧为头端）。注意其规律且节律性的收缩。右上角不透明区域为残留的腹部脂肪体；心脏两侧的圆形细胞为心周细胞。

讨论

果蝇模型已被证明是一种强大的遗传学工具，可用于研究从胚胎发育到学习与记忆等多种科学问题。近年来，这种多功能的模式生物被用于探究果蝇心脏功能的遗传机制。目前许多量化成年果蝇心脏生理的方法依赖于通过腹部体壁对完整果蝇进行观察。这些方法大多基于视觉观察或记录穿过腹部的光强度变化，以量化单一参数——心率。这些方法存在若干局限性：通常只能观察到心脏的前段区域，所观察到的实际上是心脏收缩引起脂肪体的继发性运动，且心脏仍保留完整的神经输入。成年果蝇半离体 preparations 可提供对功能性心脏更大范围的详细观察，从而能够量化除心率外的多个参数。该制备方法可用于电生理或光学记录（参见 JoVE 文章 1435）。此外，该制备也适用于组织学操作（参见 JoVE 文章 1435）。同时，还可将其作为相对纯净的心脏组织样本用于 PCR、Western 印迹、微阵列分析等实验。

对于本次解剖而言，黑腹果蝇成虫的心脏通过一束翼肌固定在腹部背侧的角质层上，因此可方便地去除头部及腹侧的腹神经索，随后在不损伤心脏的情况下移除其他内部器官。然而，在步骤3中必须格外小心，仅需剪除腹部最末端的一小部分，因为心脏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型解剖弹簧剪（弯型）	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	适用于粗略切割（步骤 3）
微型解剖弹簧剪（直型）	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 镊子	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11295-10
玻璃毛细管，100 μl	VWR international	53432-921
细玻璃毛细管	Science Products	GB100T8P
拉针仪	Sutter Equipment	P-97	水平和垂直拉针仪均可使用
塑料管	Tygon	1/16” 内径	用于 100μl 毛细管
塑料管	Tygon	1/32” 内径	用于细小毛细管
Histoacryl® 组织粘合剂	B. Braun Medical