本文描述了一种基于细胞死亡的PTI检测方法，用于Nicotiana benthamiana植物。
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摘要
摘要
为了感知环境中潜在的病原体，植物利用其质膜上存在的模式识别受体（PRR）。PRR可识别被称为病原体相关分子模式（PAMP）的保守微生物特征，这种识别会引发PAMP触发的免疫反应（PTI），从而有效阻止非病原体对植物组织的定植1,2。在PTI中研究最为深入的是FLS2依赖性通路3。FLS2可识别细菌鞭毛蛋白组分flg22这一PAMP。
成功的病原体具有毒力因子或效应子，能够抑制PTI，从而使病原体引发疾病1。相应地，一些植物具有抗性基因，可识别效应子或其活性，从而触发效应子诱导的免疫反应（ETI）2。
我们描述了一种基于细胞死亡的PTI检测方法，该方法经Oh和Collmer4的方案修改而来。该检测在N. benthamiana中进行了标准化，后者正 increasingly 被用作研究植物-病原体互作的模式系统5。通过将一种非致病性细菌菌株渗入叶片以诱导PTI。七小时后，再将一种能够致病或激活ETI的细菌菌株渗入与初始渗入区域重叠的区域。首次渗入所诱导的PTI能够延缓或阻止由第二次挑战性渗入引发的细胞死亡。相反地，若在重叠接种区域出现细胞死亡，则表明PTI已被破坏。
已标准化四种不同的PTI诱导剂与挑战性接种组合（表1）。该检测在未沉默的N. benthamiana植株上进行，作为对照；同时也在FLS2基因沉默的植株上进行，后者预计其启动PTI的能力受损。
方案
第一部分：植物生长与养护
用于检测的Nicotiana benthamiana植株应约为7周大。在检测前至少4-5天应对植株进行修剪，去除所有腋生分枝和花朵。在腋生分枝刚长出时即予以去除，有助于更好地管理植株。
第2部分：细菌培养
第1天：
- 启动实验所用所有菌株的平板或培养物，需同时进行。对于包含2种诱导菌和3种挑战菌的Pseudomonas spp.，从冻存的甘油菌种中挑取少量细菌，在含有适当抗生素的KBM平板上划线（见表2），并将少量菌液涂布于平板中央。将平板在30°C下培养约18–24小时。对于Agrobacterium，从新鲜平板上接种2 ml LB液体培养基，于30°C、250 r.p.m.条件下过夜培养。
第2天：
- 对于假单胞菌（Pseudomonas），加入150–200 μl液体KBM至细菌中，使用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布于整个平板表面。将平板放回培养箱中，继续培养20–24小时。次日平板上应形成均匀的细菌菌苔，表明菌体生长良好。对于农杆菌（Agrobacterium），在约5–10 ml LB培养基中加入20 μM乙酰丁香酮，启动二次培养，并在250 r.p.m.、30°C条件下过夜培养约20小时。
第3部分：为检测准备植物
第2天：
- 实验前一天，应将植物转移至温度为 22-24°C、相对湿度约 35-40%、持续光照的房间。
- 使用粗头黑色记号笔在直径至少为 1.5 cm 的叶片上标记圆形区域，每片叶可标记 2 至 4 个圆。圆圈之间应保持适当间距，最好不跨越大的叶脉。选择充分展开的叶片，避免选择较老、质地坚韧或较厚的叶片，并避免在叶片的下部区域标记圆圈。
实验前一天标记圆圈并非本方案的必要步骤。然而，若需要检测大量植株，则提前标记可节省时间，并有助于更精确地控制PTI诱导与挑战接种之间的时间间隔。
第4部分：PTI的诱导
第3天：
- 用10 mM MgCl2从培养板中收集P. fluorescens和P. putida的细胞。对于Agrobacterium，离心培养物以收集细胞，并重悬于10 mM MgCl2 + 10 mM MES（pH 5.6）中。重复一次离心，并将细胞重悬于MgCl2–MES溶液中。在600 nM处测定细胞的光密度（O.D.），并根据表2所述调整O.D.至最终所需值。Pseudomonas最终应重悬于10 mM MgCl2中，而Agrobacterium应重悬于MgCl2–MES溶液中。25 ml的总体积足以接种约40–50个位点。
- 使用1 ml无针头注射器将PTI诱导剂注入叶片上预先标记的圆圈内。记录植物接种的顺序以及接种开始的确切时间。
第5部分：攻毒接种
- 按照第4.1节和表2所述方法，准备丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（P. syringae pv. tomato DC3000）、P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1突变株以及丁香假单胞菌烟草致病变种（P.s. pv. tabaci）用于后续接种挑战。
- 在诱导剂浸润处理7小时后，按照与诱导处理相同的植株顺序进行接种挑战。通常可将第一次接种区域边缘处的一个点作为第二次接种区域的中心。若叶片上存在多个接种位点，需确保各次浸润区域互不重叠。
- 将实验中使用的所有菌液进行系列稀释，并涂布于含有适当抗生素的KBM或LB平板上，以确定确切的菌落形成单位（C.F.U.）数量。
第6部分：PTI分解的评分
第5天：
- 观察接种P.s.t. DC3000的区域是否出现由ETI引起的细胞死亡。若在重叠渗透区域内部出现细胞死亡，表明PTI被破坏，应记为阳性表型。
第7天：
- 观察接种了P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 或 P.s. pv. tabaci 的位点是否出现因病害导致的细胞死亡。阳性表型的评分方法同6.1部分所述。
当对照植株（不应被PTI削弱的植株）在渗透重叠区域开始出现细胞死亡时，应停止进一步的观察。
第7部分：代表性结果
图1显示了以荧光假单胞菌（P. fluorescens）作为诱导剂、丁香假单胞菌番茄致病变种（P.s.t. DC3000）作为挑战病原时的实验结果。
图 1. P. fluorescens 被注射到 N. benthamiana 叶片（黑圈）以诱导 PTI，7 小时后，该区域接种 P.s.t DC3000（白圈）。FLS2 基因沉默的植株在 P. fluorescens 注射区域表现出 PTI 的失效（A），表现为细胞死亡；而未进行基因沉默的对照植株由于 PTI 的诱导，在重叠区域无细胞死亡（B）。红色箭头指示重叠注射区域中细胞死亡的有无。照片拍摄于注射后 2 天。请点击此处查看图 1 的放大版本。
| PTI诱导剂 | 引发细胞死亡的挑战 | 细胞死亡性质 | 代码 |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomato (P.s.t.) DC30006 | ETI | Pf/DC |
| P. putida KT2440 | P.s.t. DC3000 | ETI | Pp/DC |
| P. fluorescens 55 | P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-16 | 病害 | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | 病害 | Agro/Ptab |
表1： 在PTI细胞死亡检测中用于诱导PTI和激发细胞死亡的微生物组合。
| 细菌菌株 | 筛选培养基 | 实验中使用的终末光密度（O.D.） | 对应的菌落形成单位/毫升（C.F.U./ml） |
| P. fluorescens 55 | KBM 氨苄青霉素 (100 ug/ml) | 0.5 | 1 x 109 |
| P. putida KT2440 | KBM 氨苄青霉素 (100 ug/ml) | 0.5 | 1 x 108 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB 利福平 (100 ug/ml) | 0.5 | 5 x 108 |
| P.s.t. DC3000 | KBM 利福平 (100 ug/ml) | 0.02 | 2 x 107 |
| P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 | KBM 利福平 (100 ug/ml) | 0.1 的 100 倍稀释 | 1 x 106 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM 利福平 (100 ug/ml) | 0.1 的 100 倍稀释 | 1 x 106 |
表2：检测中使用的培养条件和接种量。不同品牌的分光光度计测得的光密度（O.D.）及相应的菌落形成单位（C.F.U.）水平可能存在差异。
讨论
基于细胞死亡的检测方法可用于确定某个基因在PTI中的作用。例如，可以利用该检测方法测试目的基因的功能缺失突变体。在表1给出的诱导剂与挑战接种的4种组合中，可能只有一种组合能在特定植物背景下产生表型。我们观察到，FLS2基因沉默的植物在诱导剂与挑战接种的Pf/DC和Pf/Q1-1组合中表现出PTI的崩溃（表1）。
实验的环境条件应尽可能接近第3.1部分中所述的条件。低湿度会导致细胞死亡进程过快，从而使实验难以评分。如果本方案中描述的条件在您的实验室中不适用，可尝试调整诱导剂或挑战接种的浓度。另一个可调整的参数是诱导与挑战之间的时间间隔，但我们发现较短的时间间隔会导致对照植物的实验过快失效。
建议在实验中至少测试4-5株植物，并且阳性表型应在至少3-4次独立实验中重复出现。
致谢
感谢康奈尔大学植物病理学与植物-微生物生物学系的 Hye-Sook Oh、Joanne Morello 和 Alan Collmer 提供的宝贵讨论。感谢 Jesse Munkvold 对本文的评论。本研究由美国国家科学基金会植物基因组计划资助，资助编号 DBI-0605059（GBM）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MES | 费舍尔科技公司 | BP300-100 | 配制成1M储备液，调节pH值并过滤除菌。室温保存。 |
| 生命科学紫外/可见分光光度计 | 贝克曼库尔特公司 | DU 730 |
参考文献
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
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