Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS 细胞克隆。
本文内容
摘要
摘要
通过使用一组特定的转录因子和细胞培养条件，Yamanaka 及其同事证明，利用逆转录病毒介导的方式递送并表达 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，能够诱导小鼠成纤维细胞重编程为多能状态。1 后续研究进一步表明，使用多西环素（DOX）诱导型慢病毒递送系统，可从多种其他成年小鼠体细胞类型中生成初级和次级诱导多能干细胞（iPS 细胞）。2,3
诱导性多能干细胞（iPS细胞）在形态、增殖能力以及诱导畸胎瘤形成的能力方面与胚胎干细胞（ES细胞）相似。这两类细胞均可作为再生医学中分化细胞或组织生成的多能性起始材料。4-6 相较于ES细胞，iPS细胞还具有独特优势，因其在不涉及胚胎破坏所引发的伦理问题的前提下，仍具备ES细胞的关键特性。
本文演示了使用Stemgent DOX诱导型小鼠转录因子慢病毒套装对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行重编程的实验方案。同时我们还证明，该Stemgent DOX诱导型小鼠转录因子慢病毒套装能够在转导MEF后表达全部四种转录因子，从而诱导产生具有多能性干细胞状态的细胞，这些细胞表现出与胚胎干细胞（ES细胞）特征一致的多能性标志物。
方案
1. 胚胎成纤维细胞的病毒转导
- 实验前一天，用经ddH2O灭菌过滤的0.2%明胶包被一个15 cm细胞培养皿。将培养皿置于37°C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 吸除明胶包被培养皿中的液体，以每皿4×105个细胞的密度接种MEF细胞（我们使用了Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）。在30 ml MEF生长培养基（450 ml DMEM中添加50 ml胎牛血清、5 ml 100倍非必需氨基酸、5 ml青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺和0.5 ml 55 mM β-巯基乙醇）中，于37°C、5% CO2条件下培养两天，直至细胞融合度达到约80%。
- 吸除培养基，加入30 ml含有浓缩慢病毒的MEF生长培养基（4 × 100 μl病毒储存液 + 29.6 ml生长培养基）。轻轻摇动培养皿以确保培养基均匀分布。于37°C、5% CO2条件下过夜孵育细胞。
2. 多西环素诱导重编程
- 转导后20-24小时，用胰蛋白酶消化转导的细胞，以200 × g离心5分钟，然后重悬于ES/iPS生长培养基中（450 ml Knockout DMEM，添加50 ml ES细胞级胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺、0.5 ml β-巯基乙醇和25 μl LIF）。根据细胞培养皿的尺寸，以适当的浓度接种转导的MEF细胞（在重编程效率实验和克隆分离中，我们每10 cm培养皿接种2.5 × 105个细胞；在ICC实验中，每4孔板的每孔接种2 × 104个细胞）。在37°C、5% CO2条件下培养过夜。注意：剩余的转导细胞可冻存于液氮中，以备后续分析。
- 吸除培养基，更换为新鲜配制的ES/iPS培养基，并添加强力霉素至终浓度为2 μg/ml（我们同时设置了不加DOX的培养基作为阴性对照）。在37°C、5% CO2条件下继续培养。
3. 转导效率的免疫细胞化学分析
多西环素诱导 48 小时后，通过免疫组织化学（ICC）检测转导效率。对重铺于 4 孔板中的细胞进行 ICC 检测。以下方案中所列所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行相应调整。
- 用 PBS（不含 Mg2+ 或 Ca2+）轻轻洗涤细胞一次。
- 加入 500 μl 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温下固定细胞 15 分钟。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 500 μl 冰冷的含 0.2% Tween®-20 的 PBS 溶液，进行细胞通透处理，室温孵育 10 分钟。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 200 μl 封闭缓冲液，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性结合位点。
- 加入 200 μl 特异性一抗溶液，4°C 过夜孵育（我们使用了 Oct4、Klf4、Sox2 和 c-Myc 抗体）。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 200 μl 二抗溶液，室温避光孵育 1 小时（我们使用了驴抗兔 Rhodamine 标记二抗、驴抗山羊 AlexaFluor® 594 标记二抗、驴抗小鼠 Rhodamine 标记二抗以及驴抗兔 Rhodamine 标记二抗）。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 DAPI（终浓度为 2 μg/ml 的 PBS 溶液），孵育 10 分钟以显示细胞核。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞一次。
- 成像前加入抗荧光淬灭剂 Aqua-Mount，并使用倒置荧光显微镜进行观察。
4. 分离与扩增iPS细胞克隆
- 启动重编程过程后（如第2节所述），需监测细胞培养状态，并每48小时更换一次培养基。前12天使用含多西环素的培养基培养细胞，随后从培养基中去除多西环素，以确保后续手动挑选并扩增的iPS克隆为多西环素非依赖性。
- 应每天观察细胞形态变化，以判断重编程进程；若使用Nanog-GFP/rtTA MEF等细胞，则需同时观察形态变化和GFP荧光以识别重编程克隆。每次实验情况可能不同，但克隆通常在16至22天之间达到足够大小以便分离。在此时间段内识别出的克隆可进行手动分离，并经胰酶消化后用于扩增和分析。
- 在分离和胰酶消化重编程克隆的前一天，准备24孔板，以每孔5 × 104个细胞的密度接种经γ射线照射的饲养层MEF细胞，于37°C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 手动挑选每个iPS克隆，并通过胰酶消化使其解离为单细胞悬液。将iPS细胞以每孔2 × 105个细胞的密度重铺至已预接种γ射线照射饲养层MEF细胞的24孔板各孔中，使用ES/iPS培养基培养。置于37°C、5% CO2条件下孵育，每24小时更换一次培养基。
- 每天观察iPS克隆的生长状态及GFP荧光表达。我们通常在传代前继续培养6天。
- 判断24孔板中哪些孔的细胞均一表达GFP。对于GFP表达良好的孔，可进行胰酶消化，并按1:8比例传代至已预接种γ射线照射饲养层MEF细胞的4孔板中。这些细胞可用于通过免疫细胞化学（ICC）和碱性磷酸酶（AP）染色进行多能性标志物分析。
5. 多能性的免疫细胞化学分析
我们的免疫细胞化学检测在4孔板中扩增的细胞上进行。以下方案中列出的所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行调整。
- 用不含 Mg2+ 或 Ca2+ 的 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 每孔加入 0.5 ml 冰冷的含 0.2% Tween 20 的 PBS，4°C 孵育 10 分钟。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞三次。
- 每孔加入 200 μl 封闭缓冲液，室温孵育 1 小时以封闭非特异性结合位点。
- 加入 200 μl 特异性一抗，4°C 过夜孵育（我们使用了 SSEA-1、Nanog 和 Oct4 抗体）。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 200 μl 二抗，室温避光孵育 1 小时（我们使用了驴抗小鼠 Rhodamine 偶联抗体和驴抗兔 Rhodamine 偶联抗体）。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
- 加入 DAPI（终浓度为 2 μg/ml 的 PBS 溶液），孵育 10 分钟以显示细胞核。
- 用 PBS 轻轻洗涤细胞。
- 成像前加入抗荧光淬灭剂 Aqua-Mount，并使用倒置荧光显微镜观察。
6. 诱导多能干细胞集落的碱性磷酸酶（AP）染色
- 第4部分的iPS细胞集落也可使用市售试剂盒，按照生产商提供的方案检测碱性磷酸酶（AP）活性。
第7部分. 代表性结果
Stemgent DOX 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可用于将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）。在MEFs转导后，经多西环素处理的细胞（DOX+）中可检测到转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达，而在未处理（DOX-）的细胞中则几乎检测不到或无表达（图1）。随着时间推移（本示例中为12天的DOX处理），细胞形态逐渐发生变化，形成更大、更类似胚胎干细胞（ES细胞）的克隆，其克隆边界清晰，并呈现三维生长特征（图2a）。当撤除DOX后，部分类似ES细胞的克隆出现明显的形态逆转，但仍有大量克隆保持iPS细胞形态（图2a）。这些iPS克隆在挑取并传代后，表现出典型的多能性标志物表达，包括碱性磷酸酶（AP）、Nanog、Oct4和SSEA-1（图3）。本实验所用MEF细胞类型（Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）在重编程至多能状态时，会从内源性Nanog位点表达GFP。因此，GFP表达可作为重编程成功与否的初步指标（图3）。
图1： DOX诱导后48小时的免疫细胞化学（ICC）分析。最左侧图（-DOX）为未进行DOX诱导时四种转导因子表达的代表性阴性对照。通过相应的抗体（红色显示）检测正确表达的转录因子，并使用DAPI染色以显示细胞核。
图2： Nanog-GFP/rtTA小鼠胚胎成纤维细胞向诱导性多能干细胞状态的形态学转变。A) 100倍相差显微成像显示细胞随时间从第3天（D3+Dox）至第22天（D22）逐渐压缩并转化为iPS细胞集落的过程。多西环素（DOX）于第12天撤除。左上角图：未加DOX培养板的20倍阴性对照图像。B) DOX诱导后第18天一个典型iPS细胞集落的200倍相差显微与GFP荧光图像。C) DOX诱导后第18天另一个iPS细胞集落的200倍相差显微与GFP荧光图像。
图3： 诱导性多能干细胞（iPS）克隆的分析。（A）iPS克隆的相差显微镜图像及碱性磷酸酶（AP）染色结果（200倍放大）。（B）多能性标志物分析：左图显示相差显微镜图像与GFP重编程报告基因表达的叠加图像，GFP表达反映内源性Nanog的表达水平；中图显示多能性标志物的免疫细胞化学（ICC）染色结果；右图显示DAPI染色结果，用于显示细胞核形态（100倍放大）。
讨论
这些结果表明，Stemgent DOX 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞中外源性转录因子的表达，高效生成诱导多能干细胞（iPS）克隆。在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，可在初次感染步骤中调整活性病毒与靶细胞的比例（即感染复数，M.O.I.），以提高或降低转导效率，从而影响靶细胞群体中整合的病毒数量。其次，调整细胞暴露于DOX的时间长度可影响iPS细胞克隆生成的效率。第三，靶细胞的增殖能力会影响重编程效果，因为处于活跃生长和分裂状态的细胞更易于进行重编程。最后，当针对不同细胞数量或不同规格的组织培养皿修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞数量。
披露
作者 Brad Hamilton 受雇于 Stemgent 公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DOX 诱导型小鼠转录因子浓缩型慢病毒套装 | Stemgent | 00-0003 |
参考文献
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