脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

摘要

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。

摘要

本方案描述了同位素标记的重链与轻链酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞的培养及其经油酸处理的刺激过程。细胞采用冷冻裂解法在球磨机中进行研磨，所得研磨产物通过尿素溶解使其进入溶液状态。该方法可在细胞代谢失活的状态下实现裂解，从而保留磷酸化修饰状态，并防止细胞裂解过程中磷蛋白组的重分布。随后对蛋白进行还原、烷基化处理，并经胰蛋白酶消化。样品在C18柱上脱盐后，利用亲水相互作用色谱法（HILIC）进行分级以降低样本复杂度。HILIC柱对亲水性分子具有优先保留作用，因此特别适用于磷酸化蛋白质组学研究。在色谱洗脱过程中，磷酸化肽段通常比非磷酸化肽段更晚洗脱。分级完成后，采用固定化金属离子亲和色谱法富集磷酸化肽段，该方法依赖于磷酸化肽段与金属离子之间的电荷相互作用实现选择性富集。本方案结束时，样品已准备好用于质谱的定量分析。 关键词：酿酒酵母，油酸，同位素标记，冷冻裂解，尿素溶解，还原，烷基化，胰蛋白酶消化，C18脱盐，亲水相互作用色谱，HILIC，固定化金属离子亲和色谱，磷酸化肽段富集，质谱分析

方案

细胞生长与培养基

1. 将单个 BY4742Δarg4Δlys1 菌落接种于 100 mL 富集培养基中，过夜培养至 OD₆₀₀ 达到 1.0，然后转接至两份各 1 升的最小酵母培养基（0.17% 不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮源基础培养基，0.5% 硫酸铵）中，该最小培养基需添加全部氨基酸，并补充 20 mg/L 的天然同位素标记或重同位素标记的精氨酸（¹³C₆ ¹⁵N₄；Isotec）和赖氨酸（¹³C₆ ¹⁵N₂；Isotec）。
2. 细胞继续培养 18 小时，至 OD₆₀₀ 达到 1.8。为确保标记同位素完全掺入，细胞必须经历至少 9 代的生长。将轻同位素标记的样品离心收集，用无菌水洗涤后，重新接种至含油酸的培养基（含天然同位素标记的精氨酸和赖氨酸，0.2% 油酸（Sigma Chemicals）和 0.5% Tween 40（Sigma Chemicals））中，并继续刺激培养 85 分钟。由此获得相对于精氨酸和赖氨酸为轻同位素标记的油酸刺激样品，以及重同位素标记的葡萄糖培养对照样品。

细胞裂解、肽段的分离与组分分级

3. 称量离心管。通过离心收集样品，离心3分钟。弃去培养基并吸除多余液体。称量沉淀及离心管（通常产量在1-2克之间），然后在液氮中快速冷冻。向液氮中的冷冻沉淀中加入与沉淀重量相等体积的“研磨”缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS，Gibco），10%甘油，蛋白酶抑制剂（SigmaFAST蛋白酶抑制剂片剂，Sigma）和HALT磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific））。
4. 将研磨容器在液氮中冷冻。等待液氮停止沸腾。将沉淀连同冷冻的钢珠一起转移至研磨容器中。
5. 以600 rpm进行研磨，每个循环1分20秒，并反转方向，持续3分钟。将研磨容器再次在液氮中冷冻。重复此过程共5次，总研磨时间为15分钟。
6. 将冷冻的研磨产物收集至50 ml Falcon管中，并置于干冰上。保存于-80 °C，直至使用。
7. 配制10 ml含8 M尿素、0.1 M碳酸氢铵、0.1 M Tris（pH 8.6）的溶液。向1体积的冷冻研磨产物中加入3体积的尿素缓冲液（例如，向含1 ml PBS缓冲液的1克沉淀中加入3 ml尿素缓冲液）。立即使用探头式超声仪对混合物进行超声处理（2–10秒脉冲）。保持探头靠近管底，以防止溶液起泡。研磨产物应迅速溶解。
8. 在4°C下离心5分钟，澄清裂解液。
9. 将上清液转移至新的离心管中。
10. 新鲜配制0.5 M Tris[2-羧乙基]膦（TCEP）溶液。按1:100比例加入样品中，使终浓度为5 mM。在37°C孵育1小时。
11. 还原半胱氨酸的烷基化。待样品冷却至室温。新鲜配制1 M碘乙酰胺溶液。避光操作（可用铝箔包裹离心管）。加入碘乙酰胺至终浓度20 mM。室温避光孵育1小时。
12. 用1 M储备液配制20 mM二硫苏糖醇（DTT）在室温下淬灭碘乙酰胺，孵育1小时。
13. 使用标准Bradford或BCA法测定蛋白浓度（本方法未详述）。取样用于后续SDS-PAGE分析。
14. 为验证重同位素的掺入情况，取100 μl经还原和烷基化处理的裂解液。用dH₂O按1:4稀释，超声处理后按蛋白:胰蛋白酶50:1的比例加入胰蛋白酶。消化至少4小时，使用真空浓缩仪干燥样品，然后用C18 Ultramicrospin柱（The Nest Group）进行脱盐。
    1. 用100 μl乙腈水合柱子
    2. 用200 μl 0.1%三氟乙酸（TFA）平衡柱子
    3. 将干燥样品重悬于200 μl 0.1% TFA中，上样至柱子。以约200 × g或使液体流过柱子所需的最低转速离心
    4. 用200 μl 0.1% TFA洗涤两次
    5. 用50 μl 60%乙腈、0.1% TFA洗脱两次
    6. 在真空浓缩仪中干燥样品
    7. 将样品重悬于20 μl 0.1%甲酸中。取2 μl上样至质谱仪。通过m/z谱图中精氨酸和赖氨酸分别产生10和8道尔顿的位移，检测重同位素标记氨基酸的掺入情况。每种氨基酸的掺入率应在96–98%之间
15. 将同位素标记的重链和轻链样品按等量（以蛋白毫克数计）混合。
16. 用20%甲醇将样品按1:4稀释。
17. 按1:200比例加入胰蛋白酶。在37°C孵育过夜。
18. 通过SDS-PAGE检测消化是否完全。分别上样2 μl和4 μl消化前样品，以及8 μl和16 μl胰蛋白酶消化后样品。通过考马斯亮蓝染色观察消化是否完全。若未完全消化，可短暂超声处理样品后再次加入胰蛋白酶进行消化。
19. 在真空浓缩仪中将样品干燥。干燥后加入200 μl过滤的dH₂O，涡旋振荡至沉淀完全溶解。再次在真空浓缩仪中干燥。用dH₂O重悬，再次干燥。
20. 将沉淀重悬于0.1%三氟乙酸（TFA；Sigma）中。使用pH试纸检测pH值，应约为3。如需，可用10% TFA酸化。
21. 离心去除任何沉淀物。
22. 在Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18柱上对样品进行脱盐。切勿过载柱子。最大上样量为5 mg，但建议略少为宜。必要时可将样品分装至多个柱子。
    1. 用5 ml 100%乙腈水合柱子。以约200 × g或使液体流过柱子所需的最低转速离心
    2. 用5 ml 0.1% TFA平衡柱子。上样，收集流出液并重复上样
    3. 用5 ml 0.1% TFA洗涤。重复一次
    4. 用2 ml 60%乙腈、0.1% TFA洗脱
    5. 在真空浓缩仪中干燥样品

多肽分级分离与磷酸化多肽的纯化

1. 使用HILIC色谱柱对肽段进行分级分离。我们采用TOSOH TSK-Gel Amide-80 4.6 mm × 25 cm分析柱并配备保护柱。此步骤需耐心操作，先以90% A溶剂冲洗色谱柱2小时，随后运行两次空白梯度，再上样。该规格色谱柱的最大载样量约为XX，我们通常每轮上样不超过5 mg。
2. 溶剂A - 98%乙腈/0.1%三氟乙酸
   溶剂B - 2%乙腈/0.1%三氟乙酸
   上样条件：90% A保持20分钟，90% A至85% A梯度5分钟，85% A至60% A梯度40分钟，60% A至0% A梯度5分钟，0% A至90% A梯度5分钟。
3. 流速为1 ml/min，从85% A到60% A的梯度阶段开始，每2分钟收集一次组分。
4. 合并组分，将总组分数减少至10个。增加组分数通常可提高磷酸化蛋白质组的覆盖度。

磷酸化肽段的富集

1. 使用 PHOS-Select 铁亲和凝胶富集磷酸化肽。我们将 IMAC 树脂分装保存，以避免反复冻融。配制 50 ml 含 250 mM 乙酸和 30% 乙腈的上样溶液，用 HCl 调节 pH 至 2.7。用 500 μl 上样溶液重悬样品沉淀。检测 pH，必要时用 HCl 或 NaOH 调整。
2. 在合适的层析柱中预洗 200 μl IMAC 微珠。我们使用 Molbiotec 离心柱。
   向每份样品中加入 15 μl 50% 悬浮液（凝胶与上样溶液混合物），并在旋转仪上翻转孵育 30 分钟。保留流出液用于后续分析。
3. 用上样溶液洗涤样品 3 次，再用 500 μl 过滤的 dH₂O 洗涤 1 次。
4. 用 400 μl 50 mM Na₂HPO₄ 缓冲液（pH 8.4）洗脱肽段，洗脱时间为 2–3 分钟。将洗脱液转移至玻璃小瓶中。
5. 加入 5 μl 100% 甲酸将溶液酸化至 pH 3，液氮速冻后在真空浓缩仪中干燥样品。
6. 将磷酸化肽重悬于 200 μl 0.1% TFA 中，并按上述方法进行 C18 净化。将洗脱后的样品在真空浓缩仪中干燥。
7. 将肽段重悬于 20 μl 0.1% 甲酸中。每次质谱分析使用 2 μl，或根据需要调整用量。

注意事项

在本实验方案的大部分步骤中，您将处于“盲操作”状态。可通过 Western 印迹法以及 Bradford 或 BCA 测定法监测细胞裂解效果，胰蛋白酶消化过程也可方便地进行评估。HILIC 色谱柱将产生类似于本文所示或文献中报道的色谱图 [1, 2]，具体结果取决于所使用的液相色谱仪器。样品通过质谱进行监测；在使用高成本、高质谱精度和高分辨率仪器进行分析之前，建议先在 LCQ 或 MALDI 等低成本设备上测试样品。最后，若需将含有酸的样品干燥，应使用玻璃器皿。

讨论

该方法可富集磷酸化肽段，进而进行定量分析。本实验方案中有多个参数可以调整，但最重要的是要保持样品的磷酸化修饰状态。细胞的定量前处理可通过多种方式实现，例如，如果无法在活体（in vivo）中标记细胞，可在提取后使用如ICAT[3]或ITRAC[4]等标签，对两个细胞培养物进行差异标记以实现定量分析。

在组分分离中，最常用的方法包括通过SDS-PAGE进行的凝胶分离[5, 6]、强阳离子交换色谱（SCX）[7]以及基于HILIC的色谱方法[1, 2]。我们选择了HILIC，因为它能在梯度洗脱结束时才洗脱肽段，而不会像SCX那样在梯度初期即被洗脱；但其他研究团队也已成功使用其他方法。

使用IMAC时，您可能需要增加或减少所用树脂的量、孵育时间或洗涤次数。此外，已有研究探讨了对我们在此处提供的上样溶液初始化学条件进行调整的方法[8]。结合使用这些方法，应可实现分离出磷酸化肽纯度在60%至95%之间的样品。一旦针对您的特定体系建立了方法，便可进一步优化以获得更高的磷酸化肽得率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Isotec™ L-精氨酸13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-赖氨酸15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ 磷酸盐缓冲液（PBS）7.4 (10X) 液体	Invitrogen	70011044
SigmaFAST蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt 磷酸酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技公司	78420
Retsch PM100 球磨仪	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml 不锈钢研磨罐	Retsch	01.462.0148
超微量C18色谱柱	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	沃特斯	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm × 25 cm 分析柱	东曹株式会社	13071	这是HILIC色谱柱。
保护柱 4.6 mm 内径 × 1 cm	Tosoh Corp.	19021	我们推荐使用该保护柱以延长您的HILIC柱寿命。
PHOS-Select™ 铁亲和凝胶	Sigma-Aldrich	P9740	这是IMAC树脂。分装并保存。