脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

摘要

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。

摘要

本方案描述了同位素标记的重链与轻链酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞的培养及其经油酸处理的刺激过程。细胞采用冷冻裂解法在球磨机中进行研磨，所得研磨产物通过尿素溶解使其进入溶液状态。该方法可在细胞代谢失活的状态下实现裂解，从而保留磷酸化修饰状态，并防止细胞裂解过程中磷蛋白组的重分布。随后对蛋白进行还原、烷基化处理，并经胰蛋白酶消化。样品在C18柱上脱盐后，利用亲水相互作用色谱法（HILIC）进行分级以降低样本复杂度。HILIC柱对亲水性分子具有优先保留作用，因此特别适用于磷酸化蛋白质组学研究。在色谱洗脱过程中，磷酸化肽段通常比非磷酸化肽段更晚洗脱。分级完成后，采用固定化金属离子亲和色谱法富集磷酸化肽段，该方法依赖于磷酸化肽段与金属离子之间的电荷相互作用实现选择性富集。本方案结束时，样品已准备好用于质谱的定量分析。 关键词：酿酒酵母，油酸，同位素标记，冷冻裂解，尿素溶解，还原，烷基化，胰蛋白酶消化，C18脱盐，亲水相互作用色谱，HILIC，固定化金属离子亲和色谱，磷酸化肽段富集，质谱分析

方案

细胞生长与培养基

1. 将单个 BY4742Δarg4Δlys1 菌落接种于 100 mL 富集培养基中，过夜培养至 OD₆₀₀ 达到 1.0，然后转接至两份各 1 升的最小酵母培养基（0.17% 不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮源基础培养基，0.5% 硫酸铵）中，该最小培养基需添加全部氨基酸，并补充 20 mg/L 的天然同位素标记或重同位素标记的精氨酸（¹³C₆ ¹⁵N₄；Isotec）和赖氨酸（¹³C₆ ¹⁵N₂；Isotec）。
2. 细胞继续培养 18 小时，至 OD₆₀₀ 达到 1.8。为确保标记同位素完全掺入，细胞必须经历至少 9 代的生长。将轻同位素标记的样品离心收集，用无菌水洗涤后，重新接种至含油酸的培养基（含天然同位素标记的精氨酸和赖氨酸，0.2% 油酸（Sigma Chemicals）和 0.5% Tween 40（Sigma Chemicals））中，并继续刺激培养 85 分钟。由此获得相对于精氨酸和赖氨酸为轻同位素标记的油酸刺激样品，以及重同位素标记的葡萄糖培养对照样品。

细胞裂解、肽段的分离与组分分级

3. 称量....

讨论

该方法可富集磷酸化肽段，进而进行定量分析。本实验方案中有多个参数可以调整，但最重要的是要保持样品的磷酸化修饰状态。细胞的定量前处理可通过多种方式实现，例如，如果无法在活体（in vivo）中标记细胞，可在提取后使用如ICAT[3]或ITRAC[4]等标签，对两个细胞培养物进行差异标记以实现定量分析。

在组分分离中，最常用的方法包括通过SDS-PAGE进行的凝胶分离[5, 6]、强阳离子交换色谱（SCX）[7]以及基于HILIC的色谱方法[1, 2]。我们选择了HILIC，因为它能在梯度洗脱结束时才洗脱肽段，而不会像SCX那样在梯度初期即被洗脱；但其他研究团队也已成功使用其他方法。

使用IMAC时，您可能需要增加或减少所用树脂的量、孵育时间或洗涤次数。此外，已有研究探讨了对我们在此处提供的上样溶液初始化学条件进行调整的方法[8]。结合使用这些方法，应可实现分离出磷酸化肽纯度在60%至95%之间的样品。一旦针对您的特定体系建立了方法，便可进一步优化以获得更高的磷酸化肽得率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Isotec™ L-精氨酸13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-赖氨酸15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ 磷酸盐缓冲液（PBS）7.4 (10X) 液体	Invitrogen	70011044
SigmaFAST蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt 磷酸酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技公司	78420
Retsch PM100 球磨仪	Retsch	20.540.0001
Retsch 125 ml 不锈钢研磨罐	Retsch	01.462.0148
超微量C18色谱柱	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	沃特斯	WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm × 25 cm 分析柱	东曹株式会社	13071	这是HILIC色谱柱。
保护柱 4.6 mm 内径 × 1 cm	Tosoh Corp.	19021	我们推荐使用该保护柱以延长您的HILIC柱寿命。
PHOS-Select™ 铁亲和凝胶	Sigma-Aldrich	P9740	这是IMAC树脂。分装并保存。