本视频演示了如何利用基于荧光的方法，通过细胞培养小室测量细胞侵袭能力。
本文内容
摘要
摘要
转移性细胞的特征在于其能够侵袭基底膜并迁移到身体的其他部位。细胞必须同时具备分泌降解基底膜的蛋白酶以及迁移的能力，才能具有侵袭性。BD BioCoat 肿瘤侵袭系统为细胞提供了可评估其侵袭特性的实验条件in vitro1,2. 它由一个BD Falcon FluoroBlok 24孔插入式培养板组成，其聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的孔径为8.0微米，并均匀包被了BD Matrigel基质。这一层均匀的BD Matrigel基质充当重建的基底膜in vitro 在为研究细胞侵袭提供适当蛋白质结构的同时，真正阻隔非侵袭性细胞。涂层过程会封闭膜上的孔隙，阻止非侵袭性细胞穿过膜。相比之下，侵袭性细胞能够脱离并穿过涂层膜。可通过细胞侵袭前或侵袭后使用荧光染料（如DiIC）标记来定量检测细胞侵袭能力。12(3) 或钙黄绿素 AM，并测量侵袭细胞的荧光。由于 BD FluoroBlok 膜在 490–700 nm 波长范围内对光的阻断效率超过>99%，因此未发生侵袭的荧光标记细胞不会被底部读取式荧光酶标仪检测到。然而，已侵袭至膜下表面的细胞不再受到屏蔽，可被相应的酶标仪检测到。本视频展示了一种终点细胞侵袭实验，使用钙黄绿素 AM 检测已侵袭的细胞。
方案
使用BD钙黄绿素AM荧光染料进行标记后检测与测量
细胞在侵袭穿过BD Matrigel基质并透过BD FluoroBlok膜后进行标记，以进行定量分析。因此，仅可获得细胞侵袭的终点测量结果。
- 将细胞培养至约 80% 汇合度。
- 准备并重水化小室系统。
- 将包装从 -20°C 取出，置于室温平衡。
- 打开铝箔包装，在小室孔内加入 500 μL 预热（37°C）的培养基。于 37°C、5% CO2 条件下孵育 2 小时以完成重水化。
注意：作为细胞迁移对照使用的未包被 BD Falcon FluoroBlok 24 孔小室系统无需进行重水化。 - 重水化完成后，小心移除小室孔中的培养基，避免扰动膜上 BD Matrigel 基质层。系统现已可使用。
- 用胰蛋白酶消化单层细胞，将细胞重悬于无血清 DMEM 中，制备成浓度为 5 × 104 个细胞/mL 的细胞悬液。
注意：若使用其他类型的细胞，需确定最佳接种密度。为确定特定细胞类型在多孔生长表面的最佳接种密度，应采用一系列覆盖非多孔表面（如培养瓶、培养皿和培养板）常用接种密度范围的接种密度（细胞数/cm2）。例如，若当前接种密度为 2.5 × 105 个细胞/cm2，则可在 5 × 104 至 5 × 105 个细胞/cm2 范围内设置不同细胞浓度进行测试，以确定最佳初始接种密度。 - 向顶端室加入 500 μL 细胞悬液（含 2.5 × 104 个细胞）。
- 通过取样孔向每个基底室加入 750 μL 趋化因子（含 5% FBS 的 DMEM）。
- 将 BD BioCoat 肿瘤侵袭系统和未包被的 BD Falcon FluoroBlok 24 孔小室板置于 37°C、5% CO2 环境中孵育 20–22 小时。
- 孵育结束后，小心移除顶端室中的培养基。可通过轻弹将内容物甩入废液容器中实现。操作时切勿触碰小室系统的底面。
- 将小室系统转移至另一块 24 孔板中，每孔加入 500 μL 含 4 μg/mL Calcein AM 的 HBSS 溶液。于 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。读取荧光前无需移除下室中的 Calcein AM 溶液，因其为非荧光性活体染料，可被胞质酯酶转化为绿色荧光的钙黄绿素。
- 使用底部读板型荧光酶标仪在激发/发射波长 494/517 nm（Ex/Em）条件下检测侵袭细胞的荧光强度。增益设置需通过实验确定，但可先以中间值作为起始点。过高的增益可能导致高荧光样品使检测器饱和，从而无法获得有意义的结果。不建议使用自动增益功能（即使仪器支持）。可使用倒置荧光显微镜验证实验结果；首次进行该检测时尤其推荐此步骤。
注意：必须使用正确的板图读取小室系统，至关重要。有关加载板图的信息，请参阅 www.bdbiosciences.com 上的 BD 技术公告 No. 436，或联系 BD 技术支持（labware@bd.com）。正确的板方向为：A1 孔位于左上角，BD Falcon 标志朝向右侧，当将板插入读板仪时标志应朝右。
数据降维
数据表示如下列方程所示：
在计算细胞侵袭百分比之前，可先减去背景值
RFU = 相对荧光单位。
披露
作者为 BD Biosciences 的员工，该公司生产本文所用的试剂和工具。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD BioCoat 肿瘤侵袭系统 | BD Biosciences | 354165 或 354166 | |
| HT-1080 和 NIH/3T3 细胞 | ATCC | ||
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM；无血清） | |||
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（不含钙和镁，DPBS） | |||
| BD Falcon FluoroBlok 24 孔多孔插件系统（用于细胞迁移对照） | BD Biosciences | 351157 或 351158 | |
| 含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基 | |||
| BD Calcein AM 荧光染料 | BD Biosciences | 354216 或 354217 | |
| Hanks’ 平衡盐溶液（HBSS） | |||
| BD Falcon 24 孔板（用于细胞侵袭后标记） | BD Biosciences | 351147 | |
| 具备底部读数功能的荧光酶标仪 | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar |
参考文献
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