通过补体耗竭去除特定细胞群体

摘要

为了有效研究免疫细胞群体的功能，通常需要对其进行纯化。补体耗竭法是一种快速且经济的技术，可用于分离高纯度的免疫细胞群体。

摘要

免疫细胞群体的纯化通常是研究其独特功能所必需的。特别是实时荧光定量 PCR 和微阵列分析等分子生物学方法，要求分离出高纯度的细胞群体。常用的纯化策略包括荧光激活细胞分选（FACS）、磁珠分离法和补体介导的细胞清除法。在这三种策略中，补体介导的细胞清除法具有快速、成本低、对细胞温和以及细胞得率高的优势。补体系统由大量血浆蛋白组成，当被激活时，会启动一系列蛋白水解级联反应，最终形成膜攻击复合物，该复合物可在细胞表面形成孔道，导致细胞死亡。¹经典的补体激活途径由IgM和IgG抗体启动，最初被描述为一种杀灭细菌的机制。随着单克隆抗体（mAb）的产生，补体级联反应可用于以抗原特异性方式裂解任何细胞群体。通过向起始细胞群体中加入能够固定补体的抗原特异性抗体和兔补体，即可实现补体级联介导的细胞耗竭。细胞在37°C下孵育一小时，随后通过两轮洗涤去除裂解的细胞。具有高效补体固定能力的单克隆抗体通常可耗竭95–100%的目标细胞群体。根据目标细胞群体的纯化策略，补体耗竭可用于细胞纯化，或用于富集细胞群体，以便后续采用其他方法进一步纯化。

方案

A. 兔补体

1. 兔补体储备液应在室温下解冻，然后分装为 0.5 和/或 1 ml 体积，于 -20 至 -80 °C 冻存以长期保存。
2. 每批补体均应进行滴定，以确定最佳工作浓度。通常，1:10 至 1:20 的稀释比例为最佳。
3. 兔补体在出售前并非始终经过预灭菌处理，因此应根据细胞的最终用途，在分装冻存时或添加至细胞前对补体进行过滤除菌。

B. 抗体选择

1. 并非所有抗体都能有效激活补体，因此必须首先检测抗体的活性。
2. 小鼠和大鼠的单克隆抗体均能有效激活补体。
3. IgM类抗体通常在补体介导的细胞裂解中效率最高，其次是IgG类抗体。不同物种中，适合激活补体的IgG亚型有所不同。
4. 每种抗体都应在细胞密度为10⁷ 个细胞/毫升的条件下进行滴定，以确定最佳使用浓度。

C. 基本实验方案

1. 将起始细胞浓度调整为5 x 10⁷ 个细胞/ml，使用含热灭活FCS的培养基。细胞终体积为起始体积的两倍。注意保留部分细胞，以便后续定量检测耗竭效果。
2. 将每种抗体以预先确定的适当浓度或稀释比例加入细胞悬液中。通过轻柔颠倒充分混匀细胞。
3. 计算所需补体的用量。在室温下解冻补体储备液。若补体未灭菌，需使用低蛋白吸附的一次性注射器滤器进行过滤灭菌。在加入补体前，先向注射器中加入数毫升培养基，然后直接过滤至含有细胞和抗体的离心管中。
4. 调整离心管中的终体积，使细胞浓度达到1 x 10⁷ 个细胞/ml。
5. 于37 °C孵育1小时，每隔15分钟轻轻混匀一次。
6. 离心收集细胞，弃去上清液。
7. 用培养基洗涤两次。细胞碎片会黏附在聚苯乙烯管壁上。可通过细胞筛网过滤或密度梯度离心法去除死细胞和碎片。
8. 通过比较耗竭前后目标细胞群的比例来评估细胞纯度。流式细胞术和免疫组织化学是测定细胞纯度的两种有效方法。

代表性结果

当使用一种高效激活补体的单克隆抗体时，经过一轮处理后细胞耗竭率可超过95%。图1展示了这一结果：实验起始时小鼠脾细胞中αβ T细胞占32.2%，该比例通过流式细胞术检测TCRβ的表达（eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥）确定。我们使用针对Thy1的单克隆抗体耗竭T细胞，Thy1是一种由所有T细胞表达但其他白细胞不表达的蛋白。所用抗体为Y-19，一种大鼠IgG2c²。按照所述操作步骤处理后，TCRβ阳性细胞比例降至1.56%，耗竭率超过95%。

图1. 通过补体激活去除脾脏Thy1⁺ T细胞。 通过脾脏匀浆及红细胞裂解获得全部小鼠脾细胞。将预定浓度的抗Thy1抗体和幼兔补体加入脾细胞单细胞悬液中，使最终细胞浓度为1 × 10⁷ 个细胞/mL。37 °C孵育1小时后，细胞洗涤两次，并通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。通过流式细胞术比较去除前（左图）和去除后（右图）TCRβ+细胞的百分比，以评估去除效率。横线表示阳性染色，横线上方数字为阳性细胞百分比。

讨论

细胞群体的纯化是研究其功能时常见的实验步骤。本文介绍一种利用抗原特异性抗体和补体介导裂解技术快速高效去除特定细胞群体的方法。只要存在能够激活补体的、针对谱系特异性标志物的抗体，即可实现对该细胞群体的耗竭。本文以特异性识别Thy1的单克隆抗体为例，展示T细胞的耗竭过程；Thy1是一种几乎在所有T细胞群体中均表达的蛋白质。我们成功去除了超过95%的αβ T细胞，残余脾细胞的比例从68%提高至98%。该方法所达到的细胞纯度与其他纯化策略（包括流式细胞分选和磁珠分离）相当。补体介导的耗竭技术操作快速，一旦获得起始细胞群体，可在1.5小时内完成。该方法的另一优势在于，任何实验室均可开展，因其无需昂贵的仪器和试剂，仅需水浴锅和离心机等基本设备。兔源补体可从多家供应商以合理价格购得（见试剂表），许多单克隆抗体也可从ATCC购买并本地扩增，以控制成本。相比之下，流式细胞分选需要配备细胞分选功能的流式细胞仪，设备价格高达六位数，且需使用价格昂贵的荧光标记单克隆抗体。磁珠分离法成本适中，但仍需购买磁力架和磁珠，而这些耗材可能价格不菲；此外，某些磁珠分离方案还需额外购买层析柱。

补体介导的细胞耗竭应用中的主要障碍在于缺乏具有所需抗原特异性的补体激活型单克隆抗体。尽管人、小鼠和大鼠的抗体均具有结合补体的能力，但不同同种型之间的效率存在差异。虽然这三种物种的IgM在激活补体方面均非常高效，但IgG同种型的效果则各不相同。因此，每种单克隆抗体都必须首先通过预实验评估其补体激活效率。对于效率不够高的抗体，可进行两轮补体耗竭处理，而不会影响残留细胞群体的活力。为了节约成本，应通过滴定确定抗体的最佳有效浓度。此外，所用抗体无需纯化；杂交瘤上清液和腹水液同样有效，这对难以纯化的IgM抗体而言尤为便利。与抗体类似，补体也必须在预实验中进行滴定：补体浓度过高会导致非靶细胞群体活力下降。同样重要的是，孵育时间不得超过60分钟。

在我们的实验方案中，我们将抗体与补体共同孵育。然而，也可以先将细胞与抗体在 15–30 分钟内标记，随后在加入补体前进行洗涤。采用此策略时，务必在冰上进行抗体孵育，以防止细胞表面抗原的丢失，因为某些蛋白质会发生聚集（patching）和成帽（capping）或受体内化现象。尽管补体清除法效率很高，但与其他方法相比，其主要缺点是无法用于阳性筛选，因此难以获得特定的细胞亚群。例如，从滤泡性 B 细胞中纯化边缘区 B 细胞就较为困难，而这一分离最好通过流式细胞分选（FACS）实现。在此情况下，可利用补体激活来清除 T 细胞，从而减少需要分选的细胞数量。该策略可缩短分选时间，节省成本，并减轻对细胞的损伤。

由于特定细胞群体的纯化是常见的实验需求，已开发出多种策略。补体耗竭策略的主要优点在于成本低廉、技术操作简便且节省时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-4 周龄幼兔补体	Pel-Freez Biologicals	31061-3
水浴锅	Various	various	也可使用设定为 37 °C 的培养箱。