哺乳动物的腹腔含有多种对先天免疫反应至关重要的免疫细胞群体。为了对这些细胞进行生物化学和功能分析，需要一种高效的分离方法。本文提供了一种从小鼠腹腔中分离腹腔细胞的全面方法。
本文内容
摘要
摘要
腹膜腔是哺乳动物体内由膜包被且充满液体的腹腔，其中包含肝脏、脾脏、大部分胃肠道以及其他内脏器官。腹膜腔内栖居着多种免疫细胞，包括巨噬细胞、B细胞和T细胞。由于腹膜腔中存在大量未致敏的巨噬细胞，因此成为获取未致敏组织驻留型巨噬细胞的首选部位（1）。此外，腹膜腔在B细胞研究中也具有重要意义，因其不仅含有常规的B2细胞，还存在一种独特的腹膜腔驻留型B细胞亚群，称为B1细胞。B1细胞可进一步分为B1a和B1b两个亚群，二者可通过表面标志物CD11b和CD5的表达情况进行区分。B1细胞是天然IgM的重要来源，在抵御多种病原体的早期免疫防御中发挥关键作用（2-4）。这类细胞具有自身反应性（5），但机体如何调控其活性以防止自身免疫反应的发生，目前尚未完全阐明。相反，CD5+B1a细胞因其能够产生IL-10而具备一定的调节功能（6）。因此，腹腔B1细胞是一个有趣的细胞群体，值得深入研究，原因在于其功能多样，且在发育与调控方面仍存在诸多未解问题。由于腹腔内部缺乏明确的结构，从中分离常驻免疫细胞具有一定的技术难度。本实验方案将介绍一种从小鼠腹腔获取活免疫细胞的操作步骤，所获得的细胞可用于流式细胞术进行表型分析，以及各类生物化学和免疫学检测。
方案
- 开始操作前，需准备以下物品：
- 冰
- 带27号针头的5 ml注射器
- 带25号针头的5 ml注射器
- 用于固定小鼠的泡沫板及固定针
- 可放置固定板的托盘
- 剪刀和镊子
- 收集管
- 70% 乙醇
- 含3%胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS）（预冷并置于冰上）
- 处死小鼠，用70%乙醇喷洒，并将其仰卧固定于泡沫板上。
- 使用剪刀和镊子剪开腹膜外层皮肤，并轻轻向后剥离，以暴露覆盖腹腔内壁的内层皮肤。
- 使用27号针头将5 ml冰冻PBS（含3% FCS）注入腹腔。将针头缓慢插入腹腔，注意避免刺破任何器官。
- 注射后，轻轻按摩腹腔，使附着的细胞充分释放到PBS溶液中。
- 将连接5 ml注射器的25号针头（斜面朝上）插入腹腔，轻柔移动针尖以收集液体，避免脂肪组织或其他器官堵塞针头。尽可能收集全部液体，并在拔下针头后，将收集的细胞悬液转移至预冷的收集管中。
可选：重复步骤4–6 - 在腹腔内层皮肤上做切口，用镊子提起皮肤，使用塑料巴斯德吸管吸取腔内残留液体。
- 若在步骤6或7中发现明显血液污染，则应弃用该污染样本。
- 将收集的细胞悬液在1500 RPM下离心8分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于所需培养基或PBS中，用于细胞计数。
获取巯基乙酸盐诱导的巨噬细胞的替代方案：
该方法用于获得更高产量的巨噬细胞。
- 向每只小鼠的腹腔内注射 5 ml 的 3% (w/v) 胰酪胨大豆肉汤培养基（Brewer thioglycollate medium）(7)。
- 等待 3–5 天，然后按照上述步骤 1 操作收集细胞。
与非诱导方法相比，可收集的巨噬细胞数量大约增加10倍。唯一需要注意的是，通过该方法获得的巨噬细胞在某些生理特性上存在差异。
代表性结果：
采用良好的分离方案，可从一只未经处理的小鼠中获得500万至1000万个腹腔细胞。在所有活细胞中，B细胞占50–60%，巨噬细胞约占30%，T细胞占5–10%（图1）。
图1. 从腹腔分离的细胞表型。 分离腹腔细胞后，使用抗小鼠TCRβ-FITC、B220-PE-Texas red、CD11b-Pacific blue、CD23-PE-Cy7 和 CD5-APC 进行染色。代表性流式细胞术散点图显示了B细胞和T细胞（a）、巨噬细胞（b）、B1和B2细胞（c）以及B1a和B1b细胞（d）的比例。
讨论
分离腹腔细胞是研究不同免疫细胞（主要是巨噬细胞和特定B细胞亚群）的重要技术。尽管该过程较为简单，但仍有一些关键步骤需要注意。应避免收集的样本中混入血液污染，以获得纯净的腹腔细胞群体。通过颈椎脱臼实施安乐死时应小心操作，以防止血液进入腹腔。也可选择使用CO2法。此外，在操作过程中需特别注意避免刺破膀胱或腹腔内的其他器官。充分回收注入的液体对细胞得率也至关重要。
该方法常用于研究巨噬细胞生物学，因为与体外使用巨噬细胞集落刺激因子将髓系前体细胞分化为成熟巨噬细胞这一繁琐过程相比，可轻松从腹腔获取适量的静息态、未经刺激的巨噬细胞（8,9）。尽管使用巯基乙酸盐可能会改变巨噬细胞的生理特性（7），但采用巯基乙酸盐诱生法可提高腹腔巨噬细胞的收获量。
B细胞是我们免疫系统的重要组成部分，在先天免疫和适应性免疫中均发挥关键作用。在不同的B细胞亚群中，B1细胞是一类独特的B细胞亚群，参与先天免疫、自身免疫以及免疫调节。B1细胞主要位于腹腔内，具有自我更新能力。它们是天然IgM的主要产生细胞之一，天然IgM可为机体抵御多种病毒和细菌提供第一道防线（10-12）。B1细胞也是IL-10的主要来源之一（6），而IL-10是一种在免疫调节中起重要作用的细胞因子。尽管已有许多针对B1细胞的研究，但对其功能差异，特别是其调节作用，仍有进一步研究的空间。腹腔细胞分离方法为研究B1细胞的功能提供了独特的机会。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI069358和BloodCenter研究基金会支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良 Brewer 硫乙醇酸盐培养基 | BD Biosciences | 211716 |
参考文献
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