可视化单分子络合物在体内使用高级荧光显微

Summary

在这里，我们展示了单分子荧光显微镜，对生活的细菌细胞，使功能分子复合物进行检测，跟踪和量化的执行协议。

Abstract

全面洞察到活细胞的机制，可以实现只有通过调查的关键工序引出并直接在细胞水平上的事件。迄今为止的生物系统的剪切复杂性造成了精确的单分子实验过于苛刻，而不是单一系统使用相对粗糙的散装合奏平均测量的研究重点。然而，许多重要的过程发生在活细胞只是一个水平或几个分子;合奏测量一般掩盖这些事件的随机性和异质性。在这里，使用先进的光学显微镜和分析图像分析工具，我们演示了如何在一个单一的生活细菌细胞的单个分子的精确度，以及如何运作的生物机器，我们可以观察到分子复合物内的动态监测的蛋白质。该技术直接相关的生理。他们微创微扰和非侵入性正在研究的生物样品，并完全合拍，在物质生活的调查功能，没有现成的其他单分子生物物理的方法。此外，生物标本研究所有在未修改的细胞株（"基因组编码"），产生显着更多的蛋白质比自然发生的，而不是比较常见的，但不太理想的方法几乎相同的水平产生荧光标记的蛋白质（"质粒表达"）。因此，将调查的实际生物样品中有显着接近自然的有机体，因此观测真正的生理过程有关。

Protocol

1. 要开始此过程中，50μL荧光蛋白表达大肠杆菌细菌细胞冷冻库存首次解冻和成长翻天覆地的5毫升LB生长介质一夜之间在37度C.在早上有氧，提取50μL这个饱和文化和子成最小的M63葡萄糖培养基，在30度4至6小时的彗星孵化，培养。在这里，我们展示了使用两种不同的细胞株，其中一个表示电子传输的细胞色素融合到绿色荧光蛋白，表示有关的蛋白质融合，以绿色荧光蛋白在细菌鞭毛电机的其他。
2. 细胞可收获直接从不断增长的亚文化，如果他们作为固定样本观看，或他们可能会剪截断细菌鞭毛"拴"条件下观看。
3. 剪切涉及配售的亚文化通常为1 -5毫升成两个无菌注射器，无菌管道加入的设备。剪切是通过在每个注射泵交替推推动通过狭窄的管文化。这是50-100倍，所需的剪切程度而定。文化是离心沉淀细胞，它是悬浮在最短的媒体删除鞭毛片段。
4. 然后，我们准备在氢​​氧化钾饱和溶液浸泡20分钟乙醇清洗BK7玻璃盖玻片，然后在去离子水和乙醇和漂洗彻底离开干燥的空气中至少有1小时
5. 我们构造一个简单的流细胞内部的细胞，在显微镜。这涉及到一个BK7玻璃显微镜幻灯片上绘制石蜡油脂线，然后建立一个隧道，夹层置于顶部的清洗coverlips之一，并与一双镊子轻轻按下，让流细胞体积的5-10μL 。
6. 观察固定化细胞注射填充流动细胞与聚- L -赖氨酸0.1％W / V解决方案，并允许它在室温下孵育至少1分钟。然后，我们冲洗出来使用100μL最小的媒体，通过注入流通池的一端从其他媒体和排汗用纸巾。
7. 然后，我们....

Discussion

必须小心不要"剪切"拴细菌细胞，因为这可能会损害鞭毛马达的功能。重要的是使用细胞的显微镜玻片上一次更长的时间不到一个小时，因为他们可能成为氧气耗尽。可能需要相当大的优化，正在调查中找到最好的显微镜成像条件满足您特定的生物系统。这可能是明智的做法是企图用纯化GFP的单独确定正确的强度激光激发您的特殊的显微镜系统所需的成像。

....