人类胚胎干细胞核型分析用染色体铺展制备

摘要

核型分析是一种简单且实用的技术，广泛用于检测遗传变异。本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于制备人胚胎干细胞的染色体铺展样本，以监测在培养条件下维持的人胚胎干细胞的染色体状态。

摘要

尽管人类胚胎干细胞（hESC）已被证明具有稳定的二倍体核型 ¹许多研究报道，根据培养条件的不同，细胞容易获得染色体异常，例如整条或部分染色体的增加。事实上，在长期培养过程中，当使用酶法或化学解离方法时，可观察到核型改变。 ^2,3,4，而通过手工解剖法对克隆进行传代可维持稳定的核型 ⁵此外，环境的改变（例如去除饲养层细胞）似乎也会损害人类胚胎干细胞的遗传完整性 ^3,6. 一旦染色体改变可能影响细胞生理学，对人胚胎干细胞遗传完整性的表征就显得尤为重要 在 体外 考虑到人胚胎干细胞（hESC）是胚胎发生研究和药物测试中的重要工具，这一点至关重要。此外，对于未来的治疗应用而言，染色体改变是一个实际问题，因其常与致癌作用相关。

本文展示了一种简单且实用的方法，用于制备高质量的染色体铺展样本，以便后续通过G显带、FISH、SKY或CGH技术对染色体组进行分析^7,8。我们建议每传代5次定期检查一次染色体状态，以监测易位和非整倍性等异常的出现情况。

Priscila Britto 和 Rafaela Sartore 对本论文的贡献相同。

方案

仪器

• 组织培养孵育箱，37°C，5% CO₂
• 离心机
• 移液器套装（1000 μL，100 μL）
• 37°C 水浴锅
• 90°C 水浴锅，用于提供热水蒸汽
• 相差显微镜

第一步

用秋水仙胺处理细胞

在此实验中，我们使用了培养在经丝裂霉素C（Sigma）灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（mEF）上的H9人胚胎干细胞系，并在添加了20%敲除血清替代物（KSR，Gibco）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2，R&D）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中维持培养。

为了获得大量的中期分裂相，建议使用有丝分裂指数较高的培养物，其中含有大量正在分裂的细胞。

1. 从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台中加入秋水仙胺，使其终浓度为0,1μg/mL。
2. 将培养瓶放回培养箱，孵育3小时，使抑制剂诱导细胞发生中期有丝分裂阻滞，此时染色体高度凝集，可在显微镜下清晰观察。

固定细胞

3. 吸出培养基，加入足量的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液以覆盖细胞表面。室温孵育5分钟，然后通过添加含血清的培养基或直接向细胞中加入血清来终止酶反应。
   注意：必须确保获得单细胞悬液，以得到良好的中期分裂相。
4. 将细胞转移至15 mL离心管中，在122 g 条件下离心5分钟。
5. 弃去上清液，保留约200 mL，通过轻敲管底轻轻重悬沉淀，如视频所示。确保细胞充分分散，溶液中无可见的细胞团块。
6. 接下来需沿管壁缓慢加入5 mL预热至37°C的低渗溶液（75 mM KCl）。首先加入3 mL，将离心管轻轻倾斜或倒置至水平位置以混匀细胞与低渗溶液，然后加入剩余的2 mL，并在37°C下继续孵育15分钟。
   注意：此时低渗溶液会导致细胞体积增大，有助于染色体解聚。孵育时间对获得良好的染色体铺展至关重要。若时间过长，细胞膜可能过早破裂，导致染色体丢失；若时间过短，则因细胞膜未充分破裂而难以获得染色体铺展。
7. 加入3滴固定液（甲醇/冰醋酸 3:1），轻轻倒置离心管使固定液与细胞混匀，然后以122 g 离心5分钟，离心过程中不得使用刹车。
   注意：固定液应现配现用。
   注意：离心时必须不使用刹车，以避免细胞损伤，防止样本损失。
8. 弃去上清液，保留约200 mL，通过轻敲管底轻轻重悬沉淀。
   注意：再次确认细胞充分分散，溶液中无可见的细胞团块。
9. 沿管壁缓慢加入前3 mL固定液，同时旋转离心管。将离心管倒置至水平位置以混匀细胞，然后继续沿管壁加入另外2 mL固定液，使细胞充分沉淀。4°C过夜保存。
   注意：固定后的细胞可在4°C的固定液中保存数月。固定液不仅保护细胞处于肿胀状态，还可去除脂质并使蛋白质变性。这些变化使细胞膜变得脆弱，从而有利于染色体的铺展。

清洁载玻片

在开始制备染色体铺片之前，请确保载玻片已彻底清洁，否则可能导致部分细胞核以及中期相丢失。如果计划进行任何杂交技术操作，此步骤尤为重要⁹。

1. 将载玻片放入盛有6M HCl的烧杯中，在室温下处理至少3小时。
2. 处理结束后，用流动的自来水冲洗载玻片10分钟。
3. 用蒸馏水漂洗载玻片，并在室温下自然晾干。
4. 此时载玻片可保存在96%乙醇中，在使用前立即用无绒布擦干。

注意：对于 原位 杂交方法中，载玻片在96%乙醇中存放不得超过2天

第二步

洗涤细胞

10. 次日，以 122 g 离心细胞 5 分钟，离心过程中不刹车。
11. 弃去上清液，保留约 200 ml。轻轻弹击管壁重悬细胞沉淀，然后一边缓慢旋转离心管，一边沿管壁缓慢加入 5 ml 新鲜配制的固定液（甲醇/冰乙酸 3:1）。重复此洗涤步骤 2 次，共洗涤 3 次。
    注意：固定液应现配现用。

准备载玻片

12. 在最后一次离心步骤中，保留足够量的溶液以重悬细胞沉淀，从而获得适中的细胞密度用于制片（见图1）。
13. 将20–30 μL细胞悬液加至洁净干燥的载玻片上，移液时使枪头非常接近并平行于玻片表面。随着固定液的挥发，玻片表面会变得粗糙。
14. 立即将在空气中正面向上的玻片置于热水蒸气（90°C）中30秒，使细胞膨胀破裂。
    注意：此时固定液中的甲醇挥发，导致乙酸浓度升高，结合水分共同促进染色体铺展。
15. 使用相差显微镜观察，以确认细胞浓度和分布是否良好（见图1）。
16. 此时载玻片已准备好，可用于细胞遗传学方法检测染色体组型，如G显带（吉姆萨染色）、FISH、SKY或CGH。

重要提示

如何选择合适的中期细胞进行分析

选择圆形且孤立的中期分裂相（图2D），可避免将假性非整倍体误判为因两个或多个染色体分散重叠而导致的染色体增多，或因染色体丢失而导致的染色体减少。因此，应避免选择靠近细胞核的中期分裂相，因为部分染色体可能被细胞核遮挡（图2A和2B）。此外，应寻找呈圆形的中期分裂相，并确保没有任何染色体与中期分裂相分离（图2C）。

饲养细胞与hESC核型

对于G显带和SKY分析，hESC培养中的饲养细胞不会干扰分析结果，因为饲养细胞处于非分裂状态（经丝裂霉素C或照射灭活），不会进入中期分裂相群体。然而，在对间期细胞核进行FISH技术分析时，建议在胰酶消化前先手动收集克隆，以将hESC群体与饲养细胞分离。

图 1： 如何判断载玻片上合适的细胞密度。10倍物镜下的相差显微镜图像。（A）细胞密度过高。箭头指向与细胞核距离过近的中期分裂相。（B）细胞密度适中的载玻片。圆圈标示出与细胞核或其他中期分裂相分离的独立中期分裂相。请点击此处查看图1的放大版本。

图2：如何选择合适的中期相进行分析。染色体经DAPI染色后，使用荧光显微镜在100倍物镜下获取图像。（A）（B）应避免靠近细胞核的中期相（箭头所示）；（C）以及非圆形且染色体分散的中期相（圆圈所示）；（D）圆形的中期相是适合用于分析的良好中期相。请点击此处查看图2的放大版本。

讨论

染色体铺片的制备是通过常规技术（如G显带）以及更复杂的技术（如FISH、SKY和CGH）对胚胎干细胞遗传状态进行成功分析的关键步骤。

通过调整秋水仙胺孵育时间（取决于细胞周期长度），该操作可用于多种细胞类型。对于胚胎干细胞集落，我们孵育3小时，而对于类胚体（EB），孵育时间可长达6小时。

在处理细胞聚集体（如类胚体）时，需要充分解离以获得单细胞悬液。在此情况下，经过胰蛋白酶消化和机械解离后，可使用40μm尼龙细胞滤网（BD Biosciences），然后继续后续操作步骤（从“操作步骤”部分的第4步开始）。

在本实验方案中需注意，应将细胞悬液“紧贴”载玻片滴加，以避免染色体过度铺展，从而减少人为假象的产生。

我们认为，该实验方案不仅可被从事胚胎干细胞研究的实验室常规应用，也可为其他致力于研究各类干细胞中染色体不稳定性问题的研究人员提供一种有用且简便的工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 离心管	Techno Plastic Products	91015
秋水仙胺 Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
冰醋酸	Isofar	100
甲醇	Isofar	208
氯化钾 (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
载玻片	Bioslide	7105-1
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T4799