使用蛋白酶荧光检测试剂盒测定蛋白酶活性

摘要

蛋白酶荧光检测试剂盒旨在利用荧光测定法检测蛋白酶活性，也可用于检测微量蛋白酶污染。该方法基于蛋白酶对一种FITC标记的酪蛋白底物专有配方进行蛋白水解反应。

摘要

蛋白酶荧光检测试剂盒提供了即用型试剂，用于检测蛋白酶活性的存在。该简单的蛋白酶活性检测方法采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白作为底物。

蛋白酶活性导致FITC标记的酪蛋白底物被切割成较小的片段，这些片段在酸性条件下不会沉淀。将蛋白酶样品与底物孵育后，加入三氯乙酸（TCA）使反应体系酸化。随后对混合物进行离心，未消化的底物形成沉淀，而较小的、可溶于酸的片段则保留在上清液中。将上清液中和后，检测其中FITC标记片段的荧光强度。

所述试剂盒可检测约0.5 μg/ml浓度的胰蛋白酶蛋白酶对照（向检测中添加5 ng胰蛋白酶）。通过延长孵育时间至最多24小时，可提高该检测灵敏度。该检测在微量离心管中进行，并提供了使用比色皿或多孔板进行荧光检测的操作步骤。

方案

制备说明

孵育缓冲液、测定缓冲液和0.6 N TCA溶液均为即用型溶液。

FITC-酪蛋白底物——建议在收到FITC-酪蛋白底物后立即分装成小份，以避免反复冻融。若经历多次冻融循环，背景信号会略有升高，从而降低检测灵敏度。分装后的底物应保存于-20 °C，并避光存放。每个样品、空白或对照反应需使用20 μl的FITC-酪蛋白底物。冻融过程以及剧烈混匀或震荡可能导致FITC从酪蛋白上解离，造成背景读数升高，并减少可用于蛋白酶切割的底物量。

荧光素异硫氰酸酯（FITC）对照溶液——可将FITC对照品用测定缓冲液（Assay Buffer）重新配制成适当浓度。该溶液应新鲜配制，并避光保存。

最终的胰蛋白酶对照溶液 - 向胰蛋白酶蛋白酶对照小瓶（货号 T 6567）中加入 100 μl 的 1 mM HCl。短暂混匀以确保胰蛋白酶完全溶解。加入 900 μl 孵育缓冲液并充分混匀。或者，根据实验需要也可使用其他缓冲液。胰蛋白酶的最终工作浓度为 20 μg/μl。当准备配制胰蛋白酶对照溶液时，将一份酸性胰蛋白酶溶液与九份孵育缓冲液按比例混合。在酸性条件下储存可提高胰蛋白酶的稳定性。胰蛋白酶对照溶液对温度敏感，且在低浓度下不稳定。
请查阅试剂盒的技术公告，了解这些配制溶液的储存条件和稳定性信息。

实验步骤

1. 建议同时配制对照、空白和样品。对于每个测试样品，在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 待测样品。对于蛋白酶活性较高的样品，可能需要进行稀释。
2. 通过在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 对照样品，配制适当的对照样品（参见对照样品部分）。
3. 通过在微量离心管中加入 20 μl 孵育缓冲液、20 μl FITC-酪蛋白底物和 10 μl 超纯水，配制空白样品。
4. 轻轻混匀各管，于 37 °C 避光孵育 60 分钟。注意避免剧烈混匀，因为过度涡旋可能导致荧光背景升高，降低检测灵敏度。
   注意：可将孵育时间延长至最多 24 小时以提高灵敏度。但切勿超过 24 小时，否则 FITC-酪蛋白可能开始降解，导致荧光背景升高。
5. 孵育结束后，向每支微量离心管中加入 150 μl 0.6 N 三氯乙酸溶液。三氯乙酸具有强腐蚀性，操作时应佩戴适当的个人防护装备。
6. 轻轻混匀后，于 37 °C 避光孵育 30 分钟。
7. 以 10,000 × g 离心 10 分钟。上清液中含有酸可溶性的 FITC 标记片段，用于后续荧光测定。

荧光测量

可根据可用仪器的要求对这些方法进行放大或缩小。为与使用适当对照样品制备的标准曲线进行比较，需从每个测试样品（FLUtest）的荧光读数中减去空白样品（FLUblank）的荧光读数。

比色皿

1. 用移液器吸取10 μl上清液（步骤7）和1 ml测定缓冲液至合适的比色皿中，轻轻混匀。注意：上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2–8 °C避光保存最多24小时，之后再进行荧光测定。
2. 在激发波长485 nm、发射波长535 nm条件下记录荧光强度。

多孔板

1. 用移液器吸取10 μl上清液（步骤7）和1 ml测定缓冲液至合适的试管或小瓶中，轻轻混匀。注意：上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2–8 °C避光保存，最长可保存24小时，之后再进行荧光测定。
2. 将200 μl混合液转移至黑色96孔板的一个孔中。在激发波长485 nm、发射波长535 nm条件下记录荧光强度。
   或者

1. 取 2 μl 上清液（步骤 7）和 200 μl 检测缓冲液，加入黑色 96 孔板的一个孔中。注意：上清液与检测缓冲液的混合溶液可在 2–8 °C 避光保存，最长可保存 24 小时，之后再进行荧光检测。
2. 以 485 nm 为激发波长，535 nm 为发射波长，记录荧光强度。

对照样本

胰蛋白酶对照溶液可用于确认检测反应是否正常进行、确定检测限或绘制通用标准曲线。对于其他特定蛋白酶的检测，建议配制含有该特定蛋白酶的适当孵育缓冲液作为对照溶液。

该检测方法的检出限是指能够产生显著荧光读数的蛋白酶最低含量，该读数需高于空白样品所得数值。检出限会因仪器的灵敏度不同而有所变化。可通过胰蛋白酶对照溶液的系列稀释来制备所需的对照溶液。

读数达到空白样品所得值的120%时被认为具有显著性。通常情况下，本方法的检测限为5 ng胰蛋白酶。建议每次检测时至少运行一个5 ng胰蛋白酶的对照。浓度为0.5 μg/ml的胰蛋白酶对照溶液可在检测中产生所需的5 ng胰蛋白酶。将胰蛋白酶对照溶液（20 μg/ml）稀释40倍可得到0.5 μg/ml的对照溶液，即1份胰蛋白酶对照溶液与39份孵育缓冲液混合。

图1（胰蛋白酶活性标准曲线）：可通过将胰蛋白酶对照溶液（20 μg/ml）进行系列稀释来生成标准曲线（见图1）。每个对照样品的荧光读数均通过从其荧光值（FLUcontrol）中减去空白样品的荧光读数（FLUblank）进行校正。

使用本试剂盒和对照样品（浓度范围为 0.15 μg/ml（1.5 ng）至 2.5 μg/ml（25 ng））绘制的胰蛋白酶（产品编号 T 6567）典型标准曲线。该曲线按照所述步骤操作生成，其中第 4 步孵育时间为 30 分钟。荧光检测在多孔板中进行。

荧光素异硫氰酸酯（FITC）用作仪器校准（参见相应制造商的说明书）或确定FITC信号线性范围的对照。

讨论

我们刚刚展示了一个使用蛋白酶荧光检测试剂盒检测生物样品中蛋白酶活性的示例实验。该试剂盒已针对生理学应用中多种蛋白酶的检测进行了优化，适用于丝氨酸、半胱氨酸、金属和天冬氨酸蛋白酶的检测；但检测某些特定蛋白酶时可能需要进行方法上的调整。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶荧光检测试剂盒	Sigma-Aldrich	PF0100
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758